河豚魚、鰻魚及烤鰻中9種糖皮質(zhì)激素殘留量測(cè)定分析條件的優(yōu)化

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

10.2.1.7 分析條件的優(yōu)化

(1) 提取凈化條件的優(yōu)化

糖皮質(zhì)激素藥物屬于脂溶性激素，在結(jié)構(gòu)上都是環(huán)戊烷多氫菲衍生物，所以采用乙酸乙酯作為提取劑能夠有效地從河豚魚、鰻魚及烤鰻樣品提取此類藥物。在參考農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008方法基礎(chǔ)上，首先對(duì)樣品的提取步驟進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，稱取樣品后，先進(jìn)行氫氧化鈉溶液的皂化步驟，然后用乙酸乙酯提取，雖然經(jīng)過(guò)皂化后，提取的油脂相對(duì)較少，并且經(jīng)過(guò)Cleanert Silica固相萃取柱的凈化后，潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、可的松、甲基潑尼松龍、倍他米松、地塞米松的回收率也令人滿意，但倍氯米松、醋酸氟氫可的松的回收率很低。先用乙酸乙酯提取一次后，再進(jìn)行氫氧化鈉皂化，倍氯米松、醋酸氟氫可的松的回收率有所提高，但回收率仍然達(dá)不到60%，這說(shuō)明氫氧化鈉的皂化步驟影響倍氯米松、醋酸氟氫可的松的提取。所以本方法在進(jìn)行河豚魚、鰻魚及烤鰻樣品樣品的提取步驟時(shí)，減少了皂化步驟。在確定的方法中，稱取5g樣品后，加入15g無(wú)水硫酸鈉，以減少水分，分散魚肉組織和防止魚肉樣品在振蕩時(shí)產(chǎn)生結(jié)塊，加入25mL乙酸乙酯，用均質(zhì)器均質(zhì)1min，在振蕩器振蕩20min，以10000r/min離心10min，取.上清液至梨形瓶中。再用25mL提取一次，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45℃水浴上減壓蒸發(fā)至近干，用1mL乙酸乙酯和5mL正己烷溶解，待凈化。本方法對(duì)乙酸乙酯的提取效率也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在對(duì)添加了高濃度的糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的河豚魚肉樣品用乙酸乙酯提取二次后，再用25mL乙酸乙酯提取一次，按照本方法規(guī)定的操作步驟進(jìn)行測(cè)定，未檢出糖皮質(zhì)激素殘留。

在本方法的研究中，主要對(duì)Cleanert Silica固相萃取柱的凈化效果和洗脫效率進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。取500μL濃度為0.05μg/mL的糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在氮?dú)獯蹈蓛x.上吹干，用1mL乙酸乙酯和5mL正己烷溶解，用移液器分三次移至已用6mL正已烷預(yù)處理的Cleanert Silica固相萃取柱中，分別三次收集流出物于10mL樣品管中；然后用3×2mL正己烷洗滌Cleanert Silica固相萃取柱，分三次將收集流出物于10mL樣品管中；再用3×2mL丙酮+正己烷(4+6)洗脫劑洗脫固相萃取柱，分三次收集流出物于10mL樣品管中；將九個(gè)樣品管用氮?dú)獯蹈蓛x吹干，分別用1mL 20%乙腈水溶解，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1mL乙酸乙酯和5mL正已烷，6mL正己烷均未將糖皮質(zhì)激素洗脫下來(lái)，6mL丙酮+正己烷(4+6)可以將萃取柱.上的糖皮質(zhì)激素洗脫下來(lái)。另外用乙酸乙酯和正己烷可將大部分油脂和干擾物洗脫下來(lái)。所以，Cleanert Silica固相萃取柱的凈化效果令人滿意。本方法也對(duì)OasisHLB固相萃取柱進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，對(duì)于河豚魚、鰻魚及烤鰻樣品的凈化，無(wú)論從操作步驟、洗脫條件和凈化效果都不如Cleanert Silica固相萃取柱。

(2)色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法采用AB公司生產(chǎn)的3200 Q TRAP型號(hào)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行條件實(shí)驗(yàn)。由于9種糖皮質(zhì)激素化合物極性存在一定差異，所以采用梯度洗脫方法實(shí)現(xiàn)分離。由于潑尼松龍和可的松，倍他米松和地塞米松的母離子和子離子完全相同，在質(zhì)譜上無(wú)法區(qū)分，所以必須通過(guò)色譜實(shí)現(xiàn)分離，另外，由于倍氯米松、醋酸氟氫可的松出峰較晚，并且靈敏度相對(duì)較低，這就要求流動(dòng)相中乙腈和水的比例要達(dá)到即能達(dá)到倍氯米松、醋酸氟氫可的松分離，又要使倍氯米松、醋酸氟氫可的松的靈敏度達(dá)到要求，所以本方法最終采用的梯度洗脫程序見(jiàn)下表10-1。本方法經(jīng)過(guò)優(yōu)化梯度程序，實(shí)現(xiàn)了九種化合物的分離。

在ESI(-)模式下，糖皮質(zhì)激素化合物形成[M-H+HCOOH]-形式的分子離子峰，通過(guò)碰撞處理，子離子掃描進(jìn)一步得到定量和定性子離子碎片峰，進(jìn)而采用MRM模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本方法還對(duì)氣簾氣壓力，霧化氣壓力，輔助加熱氣壓力，去簇電壓，碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，使方法靈敏度達(dá)到了檢測(cè)需要。

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