喹諾酮類(lèi)藥物殘留分析技術(shù)前處理方法——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)凈化方法

經(jīng)典的凈化處理方法有固相萃取(SPE)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和曾藥殘留檢測(cè)要求的不斷提高，各種新技術(shù)、新手段也被用來(lái)作為生物樣品中QNs的樣品前處理方法，主要包括:固相微萃取(SPME)、基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)、分散固相萃取(DSPE)、分子印跡(MIP)、免疫親和色譜(IAC)等。

1)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

QNs的SPE凈化方法主要用于極性溶劑提取組織樣品后的凈化。通常在SPE凈化前需要用正已烷進(jìn)行脫脂。常用的SPE填料主要包括硅膠基C18、聚乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯等聚合物(如PSDVB、ENV+、SBD-RPS、HLB、StrataX等)、離子交換劑(如SCX、PRS、MPC)和納米纖維等。QNs為酸堿兩性物質(zhì)，所以SPE固相基質(zhì)對(duì)QNs的保留主要依靠樣品載液的pH。Golet等將樣品溶液調(diào)節(jié)為pH3.0，用MPC固相萃取柱凈化，回收率達(dá)80%以上。Ferdig等專(zhuān)門(mén)比較了三種不同的聚合固相萃取柱OasisHLB、IsoluteENV+、Lichrolut EN+和三種不同的硅膠基反相柱Chromabond C8、Chromabond Tetracyeline、Bakerbond phenyl的保留、凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上6種是柱對(duì)兩性QNs均能有很好的回收率，而對(duì)酸性QNs如OXO、FLU的回收率較差。Bailac等建立了SPE-HPLC方法檢測(cè)雞組織中的7種QNs(CIP、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU)。比較了Oasis HLB、Oasis mAX和SDB-RPS固相萃取柱的凈化效果，除了CIP在Oasis MAX柱的回收率低于25%，其他QNs在3種SPE柱都可以取得滿(mǎn)意的回收率，而SDB-RPS用于樣品前處理效果最好，回收率為58%～107%，LOD為10～30μg/kg。Samanidoua等用HLB固相萃取柱凈化魚(yú)肉中的7種QNs(CIP、ENR、SAR、DAN、OXO、NAL、FLU)。1g魚(yú)肉中加入5mL 0.1mol/L NaOH溶液和0.2g NaCl，渦動(dòng)1min，超聲15min后，3500r/min離心10min，取上清液。再向組織中加入3mL 0.1mol/L NaOH溶液和0.1g NaCl，渦動(dòng)、超聲、離心，重復(fù)提取1次，合并上清液，0.2um濾膜過(guò)濾，HLB固相萃取柱凈化。方法的回收率為90%～132%，RSD低于20%，LOQ為6～8ug/kg。趙思俊等建立了SPE-HPLC法檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中7種QNs的殘留。該方法采用在不借助高速離心的條件下(3500r/min)，用較短時(shí)間(渦動(dòng)10s，離心5min)，以0.05mol/L磷酸鹽溶液(pH7.0)提取兩次、HLB固相萃取柱凈化的前處理方法。應(yīng)用該方法在3h內(nèi)可完成32個(gè)組織樣品的前處理(包括提取、凈化)。在整個(gè)提取、凈化過(guò)程中僅使用了不到5mL甲醇。豬肉、雞肉中的平均回收率為70.4%～105.8%。鄧思維等建立了納米纖維SPE-HPLC檢測(cè)湯液中5種QNs的分析方法，樣品經(jīng)EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4)提取后，納米纖維(磺化聚苯乙烯-聚乙烯吡咯烷酮共紡物纖維)SPE小柱凈化富集，水淋洗，2%氨化甲醇洗脫，HPLC-FLD于激發(fā)波長(zhǎng)280nm、發(fā)射波長(zhǎng)450nm處進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(25+75+0.1，v/v/v，三乙胺調(diào)至pH2.8)。FLE、NOR、SAR、CIP和ORB的回收率為72.1%～110.3%；日內(nèi)RSD為1.6%～4.3%，日間為2.0%～4.3%，LOD為1.2-5.4g/L，LOQ為3.9-18g/L。

2)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME具有操作簡(jiǎn)便、不需溶劑、萃取速度快，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及易于與色譜、電泳等高效分離檢測(cè)手段聯(lián)用，并適用于氣體、液體和固體樣品分析的、新穎的樣品前處理技術(shù)等突出的優(yōu)點(diǎn)。與SPE相比，SPME法具有萃取相用量更少、對(duì)待測(cè)物的選擇性更高、溶質(zhì)更易洗脫等特點(diǎn)。黃京芳等采用毛細(xì)管整體柱管內(nèi)SPME與HPLC在線(xiàn)聯(lián)用測(cè)定血漿中的OFL、CIP、NOR、ENR和SAR。經(jīng)過(guò)對(duì)5種QNs在整體柱上的萃取條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，選用25mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH4.1)為固相微萃取攜帶液，解吸液和流動(dòng)相均為25mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH2.1)-甲醇-乙腈(72+20+8，v/v/v)，萃取時(shí)間為10min，萃取流速為0.04mL/min。結(jié)果在測(cè)定血漿中的5種QNs時(shí)，無(wú)基質(zhì)干擾現(xiàn)象，LOD為1.1～2.6μg/L。Theodoridis等建立了SPME方法凈化尿液中的CIP、奎寧、萘普生、氟哌啶醇和紫杉醇，離線(xiàn)HPLC-DVD檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)CIP在中性環(huán)境萃取效率最高，萃取液為0.9% NaCl溶液，解吸液為甲醇，萃取時(shí)間為20min。CIP的回收率為85%，LOQ為0.4μg/mL。

3)基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是將樣品與填料一起混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒表面，制成半固態(tài)后裝柱，然后根據(jù)“相似相溶”原理選擇合適的洗脫劑洗脫。該技術(shù)濃縮了傳統(tǒng)樣品前處理中勻漿、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等多個(gè)過(guò)程，避免了待測(cè)物在這些過(guò)程中的損失，提取凈化效率高、耗時(shí)短、節(jié)省溶劑、樣品用量少，但研磨的粒度大小和填裝技術(shù)的差別會(huì)使淋洗曲線(xiàn)有所差異，不易標(biāo)準(zhǔn)化。喬鳳霞等以C18為MSPD分散劑，采用MSPD技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，建立了MSPD-HPLC法分析牛奶和蜂蜜中4種QNs的方法，2.5ng/g和10.0ng/g添加水平，平均加標(biāo)回收率為81.9%～11.6%，RSD低于7%，LOD為0.05μg/L。王煉等建立了MSPD-LC-MS/MS方法測(cè)定畜禽肉和牛奶中的β-內(nèi)酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和QNs等20種獸藥殘留，樣品與C18填料(粒徑40～75um)混合，進(jìn)行MSPD提取，以甲醇洗脫待測(cè)物，氮?dú)獯祾?，流?dòng)相溶解殘余物后分析，方法的LOD和LOQ分別為0.05～3.05g/kg和0.16～10.0g/kg，禽畜肉和牛奶樣品的回收率分別為73.8%～101.5%和71.2%-～95.3%，RSD分別為2.0%～13.5%和2.0%～14.1%。

4)分散固相萃取(dispersive solid-phase extraction，DSPE)

DSPE是在SPME的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型樣品前處理技術(shù)。Tsai等建立了DSPE方法凈化豬肌肉組織中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。5g肌肉組織置于50mL離心管，加入5mL乙腈(含50μL 70%～72%高氯酸)，均質(zhì)后加入2g無(wú)水硫酸鎂和1g氯化鈉，振蕩混合1min，10000r/min離心4min，取1.5mL上層乙腈溶液加入裝有30mg分散吸附劑(PSA)的離心管中，立即加入10uL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，渦動(dòng)混合10s，6500r/min離心1min后，用玻璃移液管盡可能移去溶液層，固體吸附劑用氮?dú)獯蹈桑?00μL解吸溶液(水-乙腈-70%-72%高氯酸溶液)(10+2+88，v/v)加到干燥的吸附劑中，渦動(dòng)混合30s，6500r/min離心1min，過(guò)0.45um濾膜，HPLC分析。回收率為95.5%～111.0%，LOD為7.5～26.3μg/kg。曹鵬等建立了DSPE-UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)食材中11種QNs的方法。樣品用5%甲酸乙腈溶液提取后加入鹽析劑分層，提取液中加入C18和PSA填料進(jìn)行凈化，濃縮后經(jīng)C18色譜柱分離，用電噴霧離子源正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。11種藥物在1.0～100.0μg/kg范圍內(nèi)具有較好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。該方法的LOD為1.8～3.1μg/kg，LOQ為6.0～10.3μg/kg；11種藥物的回收率為70.1%～100.3%，RSD為2.42%～10.88%。

QuEChERS是近年來(lái)國(guó)際上最新發(fā)展起來(lái)的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)。其原理與DSPE相似，都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。曲斌等建立了生鮮牛乳中8種QNs的QuEChERS-UPLC-MS/MS測(cè)定方法。取生鮮牛乳樣品5g，加入5mL 0.1mol/L的EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH4.0)和20mL乙腈，振蕩提取20min，再加入Bond-ElutQuEChERS萃取劑振蕩提取5min，4℃下1000r/min離心5min，取.上清液10mL置于凈化管，渦旋1min，4℃下1000r/min離心5min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，?fù)溶后UPLC-MSMS測(cè)定。方法對(duì)QNs的測(cè)定線(xiàn)性范圍為2.0～100μg/kg，在2.0μg/kg、10ug/kg、100μg/kg低、中、高3個(gè)濃度的回收率為80%～120%，批內(nèi)、批間RSD小于20%。Karami-Osboo等報(bào)道了使用QuEChERS分散液-液微萃取法萃取測(cè)定牛奶樣品中的6種QNs(MAR、NOR、CIP、DIF、ENR和DAN)。DAN和其他QNs的LOD分別低于2.5μg/kg和15μg/kg，回收率為69.2%～104.8%，日內(nèi)和日間RSD分別為2.1%～11.1%和1.6%～6.5%。曹慧等采用QuEChERS-UPLC-MS/MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定乳制品中磺胺類(lèi)和QNs殘留。樣品加乙腈提取，經(jīng)QuEChERS凈化后，采用C18色譜柱分離，以乙腈和0.1%的甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧-正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，內(nèi)標(biāo)法定量。在1～200μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，磺胺類(lèi)和QNs的相關(guān)系數(shù)均大于0.9965，該方法的LOD在0.3～2.5μg/kg之間，LOQ在1.0～7.5μg/kg之間；添加10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg三個(gè)濃度水平，磺胺類(lèi)和QNs的平，均回收率在71.6%～120.7%之間，RSD在0.1%～7.2%之間。

5)分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology，MIT)

MIT是指為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與模板分子相匹配的聚合物制備技術(shù)，是一門(mén)源于高分子化學(xué)、生物化學(xué)、材料化學(xué)等的交叉學(xué)科。分子印跡就是仿照抗原抗體的形成機(jī)理，在印跡分子(imprinted molecule)周?chē)纬筛呓宦?lián)的剛性高分子，除去印跡分子后在聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下具有結(jié)合能力的反應(yīng)基團(tuán)，對(duì)模板分子表現(xiàn)出高度的選擇識(shí)別能力。MIT作為凈化方法被廣泛用于QNs的前處理，如分子印跡固相萃取(molecularly imprinted solid-phase extraction，MISPE)、磁性分子印跡聚合物萃取(magnetic molecularly imprinted polymer extraction，MMIPE)、水兼溶性分子印跡固相萃取(water-compatible molecularly imprinted solid-phase extraction)等。

劉芃巖等建立了復(fù)合模板印跡聚合物凈化LC-MS法測(cè)定魚(yú)肉中QNs殘留。該研究同時(shí)以L(fǎng)EV和CIP為模板分子，a-甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)為交聯(lián)劑，合成了復(fù)合模板分子印跡聚合物(MIP)，以此聚合物制備MIP-SPE柱，富集凈化魚(yú)肉樣品，結(jié)合高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜(HPLC-ITMS)同時(shí)測(cè)定魚(yú)肉中10種QNs殘留量的方法。采用2%醋酸乙腈提取樣品，提取液經(jīng)正己烷脫脂后，過(guò)自制的復(fù)合模板MIP-SPE柱凈化，以0.05%甲酸溶液和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫程序進(jìn)行色譜分離，離子阱質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量分析。方法的回收率為80.6%～104.6%，RSD小于8.6%，LOD為0.11～0.25μg/kg，LOQ為0.35～0.84μg/kg。汪雪雁等建立了分子印跡固相萃取-高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)雞肉中ENR的方法。以ENR為模板分子，MAA為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑，制備了ENR的MIP。以該聚合物為固相萃取材料制備MIP-SPE柱，采用高效毛細(xì)管電泳分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果ENR的LOD為92.02ug/kg，LOQ為336.04μg/kg，回收率為77.84%～86.52%，RSD為2.18%～3.76%。Sun等在甲醇-水體系中以O(shè)FL為模板分子、MAA為功能單體合成水兼溶性MIP，并以此聚合物為吸附劑制備SPE柱，分離凈化尿液中的9種QNs(PIP、OFL、ENO、PEF、NOR、CIP、ENR、GAT、SAR)。結(jié)果顯示，對(duì)QNs具有高親和力，凈化后HPLC檢測(cè)，LOD為0.036～0.10μg/mL。Urraca等采用MIP微球選擇性萃取雞肌肉樣品中的6種QNs，用組合篩選的方法選擇最佳聚合物合成的功能單體和交聯(lián)劑。MIP的制備使用ENO作為模板，MAA和三氟甲基丙烯酸混合作為功能單體，EDMA作為交聯(lián)劑與其他材料相比顯示出較高的QNs識(shí)別特性。使用二氧化硅作為骨架制備MIP球狀粒子，聚合物裝填于固相萃取柱內(nèi)，用體積比為20：80的乙腈-水(含0.005%三氟乙酸，pH3.0)沖洗，含5%三氟乙酸的甲醇洗脫，HPLC或者液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)檢測(cè)。雞肌肉樣品中目標(biāo)QNs的回收率為68%～102%，RSD為3%～4%(n=18)，LOD為0.2～2.7μg/kg。

6)免疫親和色譜(immunoaffinity chromatography，IAC)

IAC是以免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的柱色譜技術(shù)。其原理是將抗體與惰性基質(zhì)偶聯(lián)制成免疫吸附劑，裝柱。當(dāng)待測(cè)組分流經(jīng)IAC柱時(shí)，抗原與相應(yīng)抗體進(jìn)行選擇性結(jié)合，其余雜質(zhì)則流出IAC柱。再利用適宜的洗脫劑將抗原洗脫，使待測(cè)物得到有效分離、凈化和濃縮。并且IAC柱再生處理后可重復(fù)使用。混合抗體免疫親和柱(multi-immunoaffinity，MIAC)和高效免疫親和色譜(high-performance immunoaffinity chromatography，HPIAC)是其發(fā)展方向。MIAC是指含多種抗體或群特異性抗體的IAC柱，它能同時(shí)對(duì)多種組分進(jìn)行分離凈化，具備了處理多殘留組分的能力。HPIAC多采用鍵合相硅膠或控制孔徑的玻璃珠，是IAC的選擇性和HPLC高效分離的完美結(jié)合。

Holtzapple等以SAR為半抗原制備抗體并與蛋白G偶聯(lián)，制備免疫親和色譜柱，采用自動(dòng)在線(xiàn)免疫親和色譜方法提取雞肝臟中的4種QNs，免疫親和色譜柱洗滌后，QNs被直接洗脫到苯基反相色譜柱，以2%乙酸-乙腈(85+15，v/v)為流動(dòng)相，等度洗脫，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為280nm和444nm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)無(wú)干擾雜質(zhì)，凈化良好。在3個(gè)添加濃度(20ng/g、50ng/g和100ng/g)的回收率為85.7%～93.5%，SD低于5%，LOQ為1ng/mL，CIP、ENR、SAR、DIF的LOD分別為0.47ng/mL、0.32ng/mL、0.87ng/mL和0.53ng/mL。在另外一項(xiàng)研究中，Holtzapple等以SAR為半抗原制備高親和力的單克隆抗體并與蛋白G偶聯(lián)，制備HPIAC，將HPIAC直接與HPLC連接，分離和檢測(cè)血清中的2種QNs。由于抗體的高選擇性，該方法沒(méi)有使用有機(jī)溶劑和傳統(tǒng)的液相色譜柱。ENR的回收率為89%～102%，平均回收率為94%，LOD為0.8ng/mL；SAR的回收率為91%～106%，平均回收率為98%，LOD為1.7ng/mL。Holtzapple等還建立了在線(xiàn)HPIAC-反相HPLC-FLD方法檢測(cè)牛血清中的4種QNs(CIP、ENR、SAR、DIF)。HPIAC與反相HPLC相連接，F(xiàn)LD的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為280nm和444nm。CIP、ENR、SAR、DIF的平均回收率分別為99.2%、102.3%、97.8%和101.49%，平均日內(nèi)RSD和平均日間RSD分別為3.0%和4.9%，LOD分別為3.2ng/mL、1.8ng/mL、4.7ng/mL和2.8ng/mL，4種QNs的LOQ為3.2ng/mL。Li等建立了新型MIAC方法，將磺胺類(lèi)和QNs的廣譜特異性單克隆抗體同時(shí)偶聯(lián)與Sepharose4B，制備出可以同時(shí)分離和凈化豬和雞肌肉組織中13種QNs和6種磺胺類(lèi)藥物的IAC柱，LC-MS/MS檢測(cè)。以磺胺甲嗯唑?yàn)榘肟乖苽涞囊环N新型單克隆抗體對(duì)6種磺胺類(lèi)藥物的交叉反應(yīng)率為31%～112%，通過(guò)優(yōu)化相關(guān)條件，所制備IAC柱可以同時(shí)分離凈化QNs和磺胺類(lèi)藥物。動(dòng)物組織中19種藥物的回收率為72.6%～107.6%，日內(nèi)和日間的SD分別低于11.3%和15.4%，LOQ為0.5～3.0ng/g。趙思俊等利用IAC凈化技術(shù)建立了可同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物肝臟組織中10種QNs(MAR、CIP、NOR、DAN、LOM、ENR、SAR.DIF、OxO和FLU)的HPLC檢測(cè)方法。對(duì)利用QNs抗體制備的IAC柱的性能、操作條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化。抗體的偶聯(lián)量為5g/L，其對(duì)10種QNs的柱容量為3.75～6.67umol/L gel (1425～2135mg/L gel)，選用甲醇-PBS(7+3，v/v)作為洗脫溶液，連續(xù)使用12次后，QNs的柱容量仍能達(dá)到初始柱容量的38%～45%。IAC柱重復(fù)使用20次后，藥物的回收率與樣品的凈化效果無(wú)明顯變化。動(dòng)物肝臟組織樣品用PBS溶液提取，IAC柱凈化，HPLC-FLD檢測(cè)，方法的線(xiàn)性范圍為0.15～200μg/L，相關(guān)系數(shù)大于0.9989，LOD為0.05～0.15μg/kg，10種QNs在動(dòng)物肝臟的平均回收率為74.7%～94.8%，RSD為3.9%～12.1%。

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