喹諾酮類藥物殘留分析技術(shù)測(cè)定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(8)免疫分析法(Immunoassay，IA)

免疫學(xué)分析方法以抗原抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的，以高特異性、高靈敏度著稱，可使分析過程簡(jiǎn)化，適合復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析。QNs結(jié)構(gòu)中含有羧基，故多采用羧基與載體蛋白游離氨基進(jìn)行反應(yīng)，將QNs與載體連接合成人工抗原，進(jìn)而免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體。由于QNs的主要結(jié)構(gòu)部分相同或相似，因此某一QNs的抗體通常對(duì)其他QNs存在--定的交叉反應(yīng)。常采用的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、膠體金免疫層析(CGIA)、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)、熒光偏振免疫分析方法(FPIA)和磁微粒酶聯(lián)免疫技術(shù)(MPEIA)等。

1)酶聯(lián)免疫分析法(enzymelinkimmunosorbentassay，ELISA)

ELISA已廣泛應(yīng)用于獸藥和農(nóng)藥殘留的快速篩選檢測(cè)。大多數(shù)ELISA方法的標(biāo)記物是酶，但是也有應(yīng)用其他標(biāo)記物建立的方法，如化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)法。相對(duì)于微生物學(xué)方法和色譜方法而言，ELISA方法可以適用于大量樣本的快速分析，靈敏度高，成本低，不需要昂貴復(fù)雜的儀器，在殘留檢測(cè)中有著非常突出的優(yōu)勢(shì)。除了常用的96孔酶標(biāo)板，一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開始使用384或1536孔的酶標(biāo)板，可以顯著提高工作效率。

姜金慶等建立了同時(shí)檢測(cè)多種QNs的ELISA分析方法。以碳二亞胺(EDC)二步法合成CIP人工抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，建立QNs藥物多殘留的ELISA檢測(cè)方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線在PBS中的線性檢測(cè)范圍為0.2～376ng/mL，IC50為8ng/mL，LOD為0.1ng/mL；抗體對(duì)ENR、NOR和PEF均能特異性識(shí)別，IC50值分別為7.3ng/mL、10.6ng/mL和13.2ng/mL；標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中NaOH和甲醇的最高容忍度分別為10%和30%。牛奶中添加5ng/mL、20ng/mL和50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，CIP、ENR、NOR和PEF的回收率分別為93%～108%、96%～110%、92.5%～104%和93%～102%。Bucknall等制備了NOR的多克隆抗體，采用ELISA檢測(cè)牛奶、羊腎臟中NOR、ENR、CIP、FLU和NAL殘留，方法的回收率為64.2%～110.6%，日內(nèi)和日間RSD分別低于11.2%和10.5%，LOD低于4mg/kg。

Huet等制備的SAR單克隆抗體對(duì)SAR、NOR、FLU等15種QNs都有交叉反應(yīng)性。雞肌肉、雞蛋、腎臟等組織經(jīng)甲醇磷酸鹽提取后，用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，LOD為10～200ng/g。Lu等以PEF為半抗原，與牛血清白蛋白偶聯(lián)，免疫動(dòng)物制備抗體，該抗體具有高敏感性，在緩沖液中對(duì)PEF的IC50為6.7ppb，對(duì)FLE、ENR、OFL的交叉反應(yīng)性分別為116%、88%和10%，在0.5ppb、5ppb、10ppb、50ppb和100ppb添加水平，平均回收率為87%～103%，日間和日內(nèi)RSD分別低于為13.6%和10.9%，方法的LOQ為0.5ppb。VanCillie等利用制備的FLU人工抗原免疫產(chǎn)蛋雞，收集雞蛋并對(duì)IgY進(jìn)行分離、鑒定，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，用于測(cè)定牛奶中的FLU。生牛奶中FLU的LOD為12.5ug/kg，平均回收率為73.7%。Sheng等建立了檢測(cè)牛奶中OFL、MAR和FLE的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，LOD為0.20～0.53ng/mL。Holtzapple等制備了SAR的單克隆抗體和多克隆抗體，使用分子力學(xué)和量子力學(xué)的方法獲得了的三維分子模型，并討論了交叉反應(yīng)與結(jié)構(gòu)的關(guān)系和不同結(jié)構(gòu)部分對(duì)免疫結(jié)合反應(yīng)的作用，使得對(duì)待測(cè)物與抗體的結(jié)合有了更好的理解，由此也說明利用計(jì)算機(jī)和分子模型技術(shù)設(shè)計(jì)半抗原和預(yù)測(cè)抗體選擇性是可行的。Jiang等以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗來識(shí)別磺胺類藥物(SAs)的多克隆抗體，以堿性磷酸酶ALP標(biāo)記羊抗鼠二抗來識(shí)別QNs單克隆抗體，從而實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)牛奶中22種SAs和13種QNs殘留的雙顯色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(DC-ELISA)。該DC-ELISA方法對(duì)SAs和QNs的LOD分別為5.8μg/L和2.4μg/L；SAs和QNs在牛奶中10～100μg/L添加濃度，SAs的添加回收率為67%～101%，CV為8.1%～16.4%；QNs的添加回收率為72%～105%，CV為4.8%～9.3%。

2)膠體金免疫層析法(colloidalgold-based immunochromatographi cassay，CGIA)

CGIA是20世紀(jì)70年代開始發(fā)展起來的一種以膠體金作為標(biāo)記物，讓其和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，再利用抗原抗體反應(yīng)以達(dá)到檢測(cè)目的的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金技術(shù)具有方便快捷、特異性強(qiáng)、敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，目前已開始應(yīng)用于小分子物質(zhì)的檢測(cè)，如毒素、藥殘、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，隨著膠金技術(shù)的逐步推廣，替代ELISA方法成為各檢測(cè)機(jī)構(gòu)、廣大基層部門進(jìn)行樣本大規(guī)模篩選的首選方法勢(shì)在必行。劉烜等建立用于快速檢測(cè)肉、魚、蝦等組織中QNs殘留的CGIA方法。采用免疫競(jìng)爭(zhēng)法，將抗QNs單克隆抗體-膠體金復(fù)合物包被在膠體金結(jié)合墊上，并將人工合成的QNs抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測(cè)線(T線)，以顏色直觀顯示檢測(cè)的定性結(jié)果，靈敏度最低值可達(dá)到10ng/mL。Sheng等建立了檢測(cè)牛奶中OFL、MAR和FLE的CGIA方法，LOD為0.02～0.05ng/mL。

3)化學(xué)發(fā)光酶免疫法(chemiluminescenceenzyme-linkedimmunoassay，CLEIA)

CLEIA由化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)和酶聯(lián)免疫反應(yīng)系統(tǒng)兩部分構(gòu)成。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是指化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或者酶經(jīng)催化氧化反應(yīng)釋放大量自由基使之形成-一個(gè)不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，待其恢復(fù)到穩(wěn)定基態(tài)后，多余的能量以光子的形式發(fā)射出來，經(jīng)發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器可檢測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度。而酶聯(lián)免疫反應(yīng)系統(tǒng)是指經(jīng)催化反應(yīng)參與發(fā)光的酶標(biāo)記的生物活性物質(zhì)(抗原或抗體)進(jìn)行特異性抗原抗體免疫反應(yīng)后，形成抗原抗體免疫反應(yīng)復(fù)合物。然后根據(jù)測(cè)定的發(fā)光強(qiáng)度和催化反應(yīng)參與發(fā)光的標(biāo)記酶的關(guān)系進(jìn)行定量分析。CLEIA具有設(shè)備儀器簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、專一性、線性動(dòng)力學(xué)范圍廣、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和不具有放射性污染諸多優(yōu)點(diǎn)。李源珍等建立可同時(shí)檢測(cè)牛奶中OFL、MAR、FLE殘留的直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫法(dc-CLEIA)，方法的LOD分別為0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.04ng/mL。牛奶中的OFL、MAR、FLE用7.5%的三氯乙酸提取，200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL5個(gè)添加水平的平均回收率在75.4%～94.1%之間。張慧麗等建立了CLEIA法測(cè)定牛奶中ENR殘留，將牛奶樣品中的ENR與標(biāo)記有堿性磷酸酶的ENR同時(shí)與限量的特異性固相ENR抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，通過分離未結(jié)合的標(biāo)記抗原，測(cè)定標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，經(jīng)相應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)計(jì)算出待測(cè)抗原的含量，快速地測(cè)定牛奶中ENR殘留量，方法的LOD為239.9pg/mL，檢測(cè)范圍為350～1000pg/mL，批內(nèi)與批間RSD均小于15%。

4)熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)

FPIA與ELISA方法相比較，F(xiàn)PIA簡(jiǎn)化了操作步驟且縮短了操作時(shí)間，把非均相的反應(yīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為均相的反應(yīng)系統(tǒng)，是一種簡(jiǎn)單、可靠、快速和高效的免疫分析方法。Mi等建立了可同時(shí)檢測(cè)牛奶中5種QNs和雞肉中6種QNs殘留的單試劑FPIA方法。以最佳熒光標(biāo)記物SAR-5-羧基熒光素與QNs廣譜識(shí)別性單克隆抗體制備了免疫復(fù)合物單試劑，所建立的單試劑FPIA靈敏度高且反應(yīng)速度快，將樣品與單試劑充分混合后不需要進(jìn)一步溫育便可直接檢測(cè)。本方法對(duì)CIP的LOD為0.75ng/mL，IC50為2.17ng/mL，檢測(cè)范圍為1.2～4.0ng/mL，該方法對(duì)牛奶中5種QNs的CCβ均小于15ng/mL，對(duì)雞肉中6種QNs的CCβ均小于50ng/mL，添加空內(nèi)牛奶和雞肉樣本的平均回收率為77.8%～116%，CV低于17.4%。宋佩等以異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記沙拉沙星(SAR)合成熒光標(biāo)記物，采用薄層色譜法提純，優(yōu)化了反應(yīng)時(shí)間、標(biāo)記物和抗體的工作濃度，建立了SAR的快速FPIA分析法。該方法測(cè)定SAR在緩沖液中的IC50為43.2ug/L，檢測(cè)范圍為5.7～327μg/L；同時(shí)考察了FPIA測(cè)定SAR的動(dòng)力學(xué)過程及對(duì)其他4種QNs的交叉反應(yīng)。結(jié)果表明CIP、ENR、DAT及OFL的交叉反應(yīng)率分別為3.3%、1.8%、1.7%和0.7%；在牛奶和豬尿中SAR的回收率分別為71%～94%和74%～102%。

5)磁微粒酶聯(lián)免疫法(magnetic particle-based enzyme immunoassay，MPEIA)

MPEIA將磁微粒應(yīng)用到ELISA中，取代傳統(tǒng)的酶標(biāo)板固相載體，并利用磁性微珠在磁場(chǎng)下能夠進(jìn)行分離的原理，磁微粒與單克隆抗體連接，即為免疫磁珠，與相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗原結(jié)合后，在磁場(chǎng)的作用下，特異結(jié)合的抗原與其他未反應(yīng)物質(zhì)分離，最后通過酶聯(lián)免疫顯色反應(yīng)測(cè)定抗原含量。MPEIA克服了普通ELISA測(cè)定中的一些缺點(diǎn)，更具優(yōu)越性。Zhang等制備了CIP的特異性單克隆抗體，建立了MPEIA法檢測(cè)雞肌肉中的CIP，在0.3～24.3ng/mL濃度范圍內(nèi)，IC50和LOD分別為2.27ng/mL和0.25ng/mL。在雞肌肉中，CIP添加量為8ng/mL、20ng/mL和40ng/mL時(shí)，回收率均大于79%。建立的MPEIA分析法和ELISA呈現(xiàn)出極好的相關(guān)性?？笴IP單克隆抗體與8種QNs有著較高的交叉反應(yīng)率：ENR(110.1%)、SAR(99.7%)、DIF(75.1%)、DAN(89.8%)、NOR(110.3%)、LOM(65.2%)、OFL(75.1%)和FLU(45.0%)。此方法具有分離簡(jiǎn)單、反應(yīng)均勻、檢測(cè)快速(30min內(nèi))和結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

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