液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定河豚魚、鰻魚和烤鰻中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

9.2.3.1 適用范圍

適用于河豚魚、鰻魚及烤鰻中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。方法檢出限：均為1.0μg/kg。

9.2.3.2 方法原理

河豚魚、鰻魚及烤鰻中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留，用叔丁基甲基醚和乙酸鹽緩沖液加酶解劑提取試，經(jīng)硅膠柱凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

9.2.3.3 試劑和材料

叔丁基甲基醚、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷：色譜純；乙酸、氫氧化鈉：優(yōu)級(jí)純；乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)分析純。

3mol/L氫氧化鈉溶液：稱取120g氫氧化鈉溶于1000mL去離子水中；0.2mol/L乙酸鹽緩沖液(pH=5.2)：稱取2.52g乙酸和12.95g乙酸鈉溶解于800mL水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.2±0.1，加水定容至1000mL；溶解液：正已烷-二氯甲烷(3+2，v/v)；淋洗液：乙酸乙酯-正己烷(3+47，v/v)；洗脫液：乙酸乙酯-正己烷(3+2，v/v)。

β-葡糖苷酸酶/硫酸酯復(fù)合酶：含β-葡糖苷酸酶124400units/mL，硫酸酯酶3610units/mL。

激素及代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)純度≥97%；玉米赤霉酮，純度≥97%；己烯雌酚，純度≥99%；己烷雌酚，純度≥98%；雙烯雌酚，純度≥98%。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。再根據(jù)需要以甲醇配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保存于4℃冰箱中。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：a-玉米赤霉烯醇-4氘代，純度≥99%；己烯雌酚-8氘代，純度≥98%。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量a-玉米赤霉烯醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇分別配制成1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。再以甲醇稀釋成適用濃度的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，保存于4℃冰箱中。

硅膠固相萃取柱：500mg，3mL。

9.2.3.4儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧電離源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；自動(dòng)固相萃取儀或固相萃取裝置；高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速大于10000r/min；氮?dú)獯蹈蓛x；烘箱：控溫精度±1℃；渦旋振蕩器；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速大于3000r/min；pH計(jì)：測(cè)量精度±0.3pH單位；具塞離心管：25mL，50mL；微量注射器：100μL。

9.2.3.5 樣品前處理

(1) 試樣制備

取有代表性樣品500g，絞碎后攪拌均勻，制成實(shí)驗(yàn)室樣品。試樣分為兩份，置于樣品盒中，密封，并做上標(biāo)記。將試樣于-18℃下保存。

(2) 樣品稱取

稱取5個(gè)陰性樣品，每個(gè)樣品為5g(精確到0.1g)，將上述樣品置于50mL離心管中分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使各被測(cè)組分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、已烯雌酚和雙烯雌酚的濃度分別為2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分別加入適量?jī)?nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其濃度均為10ng/mL。

(3) 提取

加入20mL叔丁基甲基醚，在10000r/min均質(zhì)1min。3000r/min離心5min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至另一50mL具塞離心管中備用。離心管中的殘?jiān)糜谕L(fēng)櫥中揮發(fā)30min，加入15mL乙酸鹽緩沖液，高速均質(zhì)1min，3000r/min離心5min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至另一25mL具塞試管中，并在氮吹儀上于40℃水浴中吹去殘余叔丁基甲基醚后，加入80μL β-葡糖苷酸酶混勻，于52℃烘箱中放置過(guò)夜。在此緩沖溶液中加入氫氧化鈉溶液將溶液pH調(diào)至7，加入10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min離心2min。移取叔丁基甲基醚層與前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮吹儀上于40℃水浴中吹干。加入1mL溶解液，渦旋30s溶解，待凈化。

(4) 凈化

固相萃取凈化條件：用6mL正己烷分兩次預(yù)洗硅膠柱，流速均為4mL/min。上樣，流速為2mL/min，在樣品試管中加入3mL淋洗液，混合后過(guò)柱，流速為2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加入2mL空氣以4mL/min的速度吹過(guò)硅膠柱。用6mL洗脫液洗脫，流速為2mL/min，加入2mL空氣以6mL/min的速度吹過(guò)硅膠柱，收集洗脫液。將洗脫液在氮吹儀上于40℃水浴中吹干，加入1mL流動(dòng)相，渦旋30s溶解。溶液過(guò)0.2μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

(5) 實(shí)測(cè)樣品溶液的制備

稱取待測(cè)樣品5g(精確到0.1g)于50mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液，使其最終定容濃度均為10ng/mL。按上述步驟操作。

(6) 空白基質(zhì)溶液的制備

稱取陰性樣品5g(精確到0.1g)于50mL離心管中，按上述步驟操作。

(7) 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液混合后在氮吹儀中吹干，以基質(zhì)提取液溶解，渦旋30s后即為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

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