糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥殘留分析技術(shù)測(cè)定方法——液相色譜-質(zhì)譜法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(4)液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

在GCs殘留分析中，HPLC法難以區(qū)分互為差向異構(gòu)體的地塞米松和倍他米松，而GC-MS雖然可以做定性分析，但是需要復(fù)雜的衍生化過(guò)程。隨著LC-MS技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)成為檢測(cè)這類(lèi)藥物的首選。主要采用電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)兩種電離方式。

1)APCI電離

Cherlet等建立了定量測(cè)定牛奶中地塞米松的LC-APCI-MS/MS檢測(cè)方法。10mL牛奶中加入20%三氯乙酸(w/v)，渦動(dòng)混勻后離心，沃特曼濾紙過(guò)濾，C18固相萃取柱凈化，LC-MS/MS檢測(cè)。方法CCa和CCβ分別為0.48ng/mL和0.76ng/mL。該作者等還采用類(lèi)似的技術(shù)建立了牛血漿和組織中地塞米松的測(cè)定方法。方法LOQ為：肌肉、腎0.375ng/g，肝1ng/g，血漿1ng/mL；LOD為：肌肉0.09ng/g，腎0.13ng/g，肝0.33ng/g。

2)ESI電離

A.單級(jí)質(zhì)譜(LC-MS)

Pavlovic等報(bào)道了采用液相色譜-單級(jí)四極桿質(zhì)譜(LC-MS)測(cè)定牛尿中皮質(zhì)醇、可的松、潑尼松龍和潑尼松的方法。樣品過(guò)濾、酶解和SPE凈化后，進(jìn)LC-MS分析。Restek UItra II Allure Biphenyl色譜柱分離，等度洗脫，在EST、SIM模式下，監(jiān)測(cè)離子[M+COOHT-]-、[M-H+]-和[M-H+-CH2O]-，以氟米松為內(nèi)標(biāo)定量。方法RSD小于17%。Panderi等報(bào)道了采用ESI技術(shù)檢測(cè)綿羊血漿中地塞米松的LC-MS方法。使用65%甲醇-水溶液(含0.1%甲酸，v/v)作為流動(dòng)相，流速0.30mL/min。在ESI正離子、SIM模式下檢測(cè)。方法線性范圍在6～1000ng/mL之間，日內(nèi)、日間RSD均小于24.1%，方法LOD和LOQ分別為1ng/mL和6ng/mL。

B.串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)

Chen等建立了牛、豬、羊可食組織中8種GCs的LC-MS/MS測(cè)定方法。樣品采用PLE提取，LC-MS/MS在ESI負(fù)離子模式下，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)測(cè)定。在0.5～6μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，方法回收率在70.1%～103.1%之間，LOQ在0.5～2μg/kg之間。Shao等建立了LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定豬肉、豬肝、豬腎中16種GCs的殘留分析方法。經(jīng)BEHC18色譜柱分離后，在ESI負(fù)離子模式下采用LC-MS/MS測(cè)定。16種藥物的線性范圍在1～250μg/L之間；LOQ在0.1～1.0μg/kg之間；在添加濃度0.4～2.0μg/kg范圍，回收率為81.0%～112.3%。Tolgyesi等建立了一種應(yīng)用LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定牛肌肉、肝臟和腎臟樣品中8種GCs殘留的方法。該作者首次應(yīng)用LC-MS/MS測(cè)定了牛組織中甲潑尼松及其主要代謝物。研究表明，較強(qiáng)的樣品凈化效果能夠產(chǎn)生更加干凈的監(jiān)測(cè)基線，可以在MS/MS檢測(cè)器中設(shè)置較高的電子倍增電壓(DeltaEMV)。EMV為500V時(shí)信號(hào)的響應(yīng)得到了改善，但是噪聲水平?jīng)]有變化，因此，總體靈敏度和分析限得到了提高。在HPLC分離中，使用Kinetex phenyl-hexylcore-shell柱，使地塞米松和其β-差向異構(gòu)體、β-米松在12min內(nèi)被洗脫并能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，進(jìn)一步提高了靈敏度。每種基質(zhì)中GCs的LOQ和LOD范圍分別為0.01～13.3μg/kg和0.01～0.1μg/kg。Dusi等建立了同時(shí)測(cè)定肝臟中9種GCs的LC-MS/MS方法。肝組織經(jīng)酶解后萃取，OasisHLB固相萃取柱凈化，采用LC-MS/MS在ESI模式下，以氘標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量測(cè)定。分析樣品中濃度大約為1μg/kg的GCs均能被檢測(cè)到，所有待測(cè)物的回收率均高于62%，重復(fù)性和再現(xiàn)性分別均低于7.65%和15.5%。Deceuninck等采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了肝臟樣品中地塞米松、倍他米松、潑尼松龍和甲潑尼龍的殘留分析方法。通過(guò)選擇性較強(qiáng)的樣品前處理，結(jié)合UPLC-MS/MS高靈敏度測(cè)定系統(tǒng)，將地塞米松和倍他米松兩種異構(gòu)體有效分離，可以定性和定量測(cè)定復(fù)雜生物基質(zhì)中這4種GCs。結(jié)果表明，該方法具有較好的重復(fù)性，即使在非常低的濃度水平也能鑒定化合物。Tolgyesi等建立了豬脂肪中5種GCs(潑尼松龍、甲基強(qiáng)的松、氟米松、地塞米松和甲潑尼龍)的LC-MS/MS檢測(cè)方法。樣品用正己烷溶解，甲醇-水(50+50，v/v)提取，HLB柱凈化后，進(jìn)LC-MS/MS分析。以pH5.4甲醇-乙酸緩沖液為流動(dòng)相，Ascentis Express Fused-Coretype色譜柱分離，等度洗脫，7.5min內(nèi)完成分離測(cè)定。方法平均回收率在81%～100%之間，室內(nèi)重現(xiàn)性為8.0%～20.5%；具有限量化合物的CCa為4.5～11.9.ug/kg，禁用化合物為0.1～0.2ug/kg；方法LOD在0.1～0.3μg/kg之間。

Li等建立了同位素稀釋LC-ESI-MS/MS法，快速同時(shí)測(cè)定牛奶中的地塞米松和倍他米松。樣品直接用C18固相萃取柱凈化，洗脫液氮?dú)獯蹈桑鲃?dòng)相溶解，采用Hypercarb色譜柱，以乙腈-水-甲酸溶液(95+5+0.5，v/v)為流動(dòng)相，進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，D-4地塞米松作為同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。雖然地塞米松和倍他米松互為差向異構(gòu)體，Hypercarb C18液相色譜柱很容易將它們快速分離，且峰形較好，在空白組織中未見(jiàn)干擾。研究還發(fā)現(xiàn)，GCs在ESI質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰有[M+H]+、[M-H]-、[M+HCOO]-等多種形式。該方法選擇[M+HCOO]-作為準(zhǔn)分子離子峰，并對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后各離子對(duì)錐孔電壓均為25V，m/z437/361和m/z441/363兩離子對(duì)碰撞能量為20eV，m/z 437/307.4離子對(duì)碰撞能量為35eV。該方法用于牛奶中地塞米松和倍他米松的殘留檢測(cè)，單個(gè)樣品的總分析時(shí)間約35min。崔曉亮等建立了UPLC-MS/MS檢測(cè)牛奶中的12種GCs(潑尼松、潑尼松龍、可的松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、地塞米松、倍氯米松、氟米松、醋酸氟氫可的松、布地耐德、曲安奈德、氟輕松)殘留的方法。牛奶試樣經(jīng)甲醇提取，正己烷脫脂，SPE凈化，UPLC-MS/MS分析。色譜柱為C18柱(100mm×1.0mmi.d，1.7μm)，柱溫40℃，樣品溫度10℃，進(jìn)樣體積2μL，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液和甲醇，線性梯度洗脫，流速0.1mL/min；EST電離，毛細(xì)管電壓3.00kV，錐孔電壓45V，射頻透鏡1和2的電壓分別為27.0V和0.0V，離子源溫度99℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣流量500L/h，碰撞梯度為2.0，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。該方法的LOD為0.02～0.38μg/kg，LOQ為0.07～1.27μg/kg，回收率為69.3%～94.3%，RSD為3.5%～16.7%。

Yang等利用LC-ESI-MS/MS檢測(cè)肌肉、牛奶和肝臟中的50種同化激素(包括曲安西龍、潑尼松、可的松、氫化可的松、潑尼松龍、氟米松、醋酸氟氫可的松、甲潑尼龍、倍氯米松、地塞米松、曲安奈德、氟輕松、布地奈德、丙酸氯倍他索等GCs)。樣品經(jīng)芳基硫酸酯酶/葡糖醛酸糖苷酶于37℃過(guò)夜水解，甲醇提取，石墨化炭黑和氨基SPE柱凈化，LC-ESI-MSMS測(cè)定。方法LOQ為0.04～2.0μg/kg，平均回收率為76.9%～121.3%，CV為2.4%～21.2%。

童穎等建立了同時(shí)測(cè)定豬血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的LC-MS/MS法。血漿樣品經(jīng)酸化后以乙醚-環(huán)已烷(4+1，v/v)提取，LC-MS/MS分析。以HederaODS-2(150mm×2.1mm，5um)為分析柱，流動(dòng)相為5mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%乙酸)-甲醇，梯度洗脫。二丙酸倍他米松、倍他米松及內(nèi)標(biāo)布地奈德的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為m/z563.2([M+CH3COO]-)→483.1、m/z451.2([M+CH3COO]-)→361.0和m/z489.3([M+CH3COO]-)→357.1。二丙酸倍他米松血藥濃度在26.85～644.4ng/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，倍他米松血藥濃度在10.62～637.2ng/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。雍莉等建立了LC-MS/MS方法同時(shí)測(cè)定血漿中的腎上腺素、去甲腎上腺素、可的松和氫化可的松。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白和萃取后，15000r/min離心5min，取上清液進(jìn)樣分析。ESI正離子檢測(cè)，MRM方式定量分析。腎.上腺素、去甲腎上腺素、可的松和氫化可的松在0.02～200.00ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，LOD分別為4.13pg/mL、4.64pg/mL、4.29pg/mL和4.52pg/mL，日內(nèi)和日間精密度分別為1.19%～5.42%和2.16%～6.04%，用于血漿樣品分析，加標(biāo)回收率為80.0%～109.0%，樣品測(cè)定精密度為3.93%～7.57%。Leporati等采用LC-MS/MS開(kāi)發(fā)了尿液中潑尼松龍及其4種代謝物的分析方法，LOD在0.35～0.42ng/mL之間。

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