硝基咪唑類藥物殘留分析技術(shù)——提取方法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

16.1.4 殘留分析技術(shù)

硝基咪唑類藥物殘留受到各國(guó)政府的關(guān)注，其殘留檢測(cè)方法研究較多，目前主要采用儀器分析方法。Polzer等8確定了火雞服用硝基咪唑類藥物后應(yīng)該檢測(cè)的目標(biāo)化合物。比較了MNZ、RNZ、DMZ、IPZ及其相應(yīng)的羥基化代謝產(chǎn)物MNZOH、HMMNI、IPZOH在火雞各組織中的含量及穩(wěn)定性。檢測(cè)MNZ和RNZ時(shí)應(yīng)該選擇原藥作目標(biāo)化合物；在檢測(cè)DMZ和IPZ時(shí)，應(yīng)選擇其代謝產(chǎn)物HMMNI和IPZOH作為目標(biāo)化合物。

16.1.4.1 前處理方法

前處理中往往涉及濃縮吹干等步驟，本類藥物蒸汽壓較高，易被溶劑或氣流帶出損失，所以蒸發(fā)溫度不宜過(guò)高，吹蒸速度不宜過(guò)快，不要將樣品蒸干，應(yīng)緩緩吹入氮?dú)饣蚩諝狻?/p>

(1)提取方法

提取是將生物樣品中的殘留藥物通過(guò)適宜的溶劑轉(zhuǎn)移出來(lái)，并盡量減少共萃取的樣品基質(zhì)。樣品基質(zhì)中硝基咪唑類藥物及其羥基代謝物在常溫下降解迅速，視網(wǎng)膜和血漿中樣品穩(wěn)定性比肌肉和肝臟中高，合理的方法還應(yīng)該保證分析物的穩(wěn)定性。早期研究將樣品調(diào)節(jié)pH3，用蛋白酶過(guò)夜酶解提取與組織蛋白結(jié)合的殘留物，但近期研究表明沒(méi)必要酶解。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

由于該類藥物的堿性性質(zhì)，在酸性條件下溶于水，在堿性條件下溶于有機(jī)溶劑，組織提取物用酸性水溶液復(fù)溶后，可用二氯甲烷或正己烷除脂。硝基咪唑類藥物的提取用乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和甲苯等，溶劑極性不同，共萃取的雜質(zhì)也不同，后續(xù)凈化方法也不相同。其中應(yīng)用乙腈和乙酸乙酯的報(bào)道最多，禽蛋類樣品應(yīng)用乙腈提取比乙酸乙酯更好，可以避免乳化現(xiàn)象。提取溶劑常加入適量的鹽可促使溶劑與樣品基質(zhì)相分離，減少和沉淀共萃取物，其中氯化鈉應(yīng)用最多。提取液常用氮?dú)獯抵两?，該步驟很關(guān)鍵，因?yàn)檫^(guò)熱和干燥可能導(dǎo)致分析物揮發(fā)。乙酸乙酯沸點(diǎn)相對(duì)較低，加入少量的高沸點(diǎn)溶劑如二甘醇(沸點(diǎn)241℃)作為保持劑，可防止因蒸發(fā)溫度過(guò)高引起藥物揮發(fā)損失。

A. 乙腈提取

乙腈沉淀蛋白效果較好，與水性基質(zhì)互溶，是提取組織中硝基咪唑類藥物常用溶劑之一。乙腈用于提取禽肉類樣品，回收率在79%～93%之間。Wang等用乙腈提取禽肉中MNZ、DMZ和RNZ，回收率在80%～90%之間，變異系數(shù)(CV)小于14.3%。Thompson等用乙腈提取動(dòng)物腎臟、肝臟、牛奶和禽蛋中6種硝基咪唑及其代謝物，經(jīng)免疫傳感器測(cè)定，DMZ、RNZ、IPZ的檢測(cè)能力(CCβ)小于1μg/kg，DMZOH、IPZOH的CCβ小于3μg/kg，MNZ和MNZOH的CCβ小于2μg/kg，但未測(cè)定回收率。Cronly等用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)測(cè)定了牛奶和蜂蜜中的CNZ、TNZ、TIZ、ORZ、RNZ、DMZ、MNZ、IPZ、IPZOH、HMMNI和MNZOH。3g蜂蜜加5mL水，完全溶解混勻后，加10mL乙腈、2g氯化鈉，振搖，離心，上清液用正己烷脫脂后測(cè)定；1mL牛奶用2mL乙腈、0.5g氯化鈉提取，振蕩離心后取上清液測(cè)定。以HMMNI-d3、MNZOH-d2、DMZ-d3、RNZ-d3作為內(nèi)標(biāo)定量。牛奶的回收率為90.8%～108.9%，檢測(cè)限(CCa)和CCβ分別為0.41～1.55μg/L和0.70～2.64μg/L；蜂蜜中CCa和CCβ分別為0.38～1.16ug/kg和0.66～1.98ug/kg。

B. 乙酸乙酯提取

乙酸乙酯與組織也有一定相溶性，適用于提取中等極性藥物，很多研究采用乙酸乙酯提取組織中硝基咪唑類藥物，但需要注意的是乙酸乙酯提取液中往往含有較多的脂肪，脫脂凈化步驟必不可少。Sun等用乙酸乙酯提取禽和豬肉中7種硝基咪唑(包括MNZ、RNZ、DMZ、TNZ、ORZ、SNZ以及RNZ和DMZ的共同代謝物HMMNI)。7種硝基咪唑類藥物檢測(cè)限(LOD)為0.2μg/kg，雞肉、豬肉中藥物回收率為71.4%～99.5%，CV分別為6.2%～13.9%和4.0%～8.7%。Zeleny等直接用乙酸乙酯提取豬肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH、IPZOH和HMMNI，提取液上清液蒸干后流動(dòng)相復(fù)溶，進(jìn)LC-MS測(cè)定，回收率為101%～107%，CCa和CCβ分別為0.29～0.44μg/kg和0.36～0.54μg/kg。黎翠玉等采用乙酸乙酯提取動(dòng)物源食品中MNZ、DMZ和RNZ及其代謝物MNZOH、HMMN殘留，LC-MS測(cè)定。方法回收率在61.1%～108.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%～6.3%，定量限(LOQ)為0.1μg/kg。Zhou等報(bào)道用乙酸乙酯提取蜂蜜中MNZ、RNZ、DMZ、TNZ和HMMNI的殘留。MNZ、DMZ、RNZ、TNZ和HMMNI的LOD為1.0～2.0ng/g，平均回收率為71.5%～101.4%。劉玉芳等建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定鹽漬羊腸衣中2種硝基咪唑殘留量。先用甲醇-丙酮均質(zhì)，以乙酸乙酯萃取提取鹽漬羊腸衣中硝基咪唑類殘留物。測(cè)定出甲硝唑和洛硝噠唑的LOD均為0.5ng/mg，甲硝唑和洛硝噠唑的LOQ均為1.0ng/mg；在添加水平0.5ng/mg、1.0ng/mg、2.0ng/mg的回收率為62.7%～70.37%，RSD為3.4%～5.8%。在堿性條件下，本類藥物以分子形態(tài)存在，易溶于有機(jī)溶劑，乙酸乙酯的提取效率提高。Sakamoto等提取魚肉中MNZ、DMZ和RNZ殘留。5g組織加入1g碳酸氫鈉后用乙酸乙酯提取，LC-MS/MS測(cè)定?；厥章蕿?1.2%～107.0%，LOD為0.05～0.2μg/kg。丁濤等用4mL 0.25mol/L氫氧化鈉溶液-乙酸乙酯將蜂王漿中MNZ、DMZ和RNZ提取至乙酸乙酯相。DMZ的LOQ為2.0μg/kg，MNZ和RNZ為1.0μg/kg；回收率和CV分別為96.6%～110.6%和2.1%～7.4%。

C. 二氯甲烷提取

二氯甲烷與乙酸乙酯化學(xué)性質(zhì)相似，但二氯甲烷密度較大，提取完成離心后基質(zhì)浮在提取液上方，后續(xù)操作應(yīng)盡量減少二次污染。用二氯甲烷提取時(shí)加入無(wú)水硫酸鈉可以吸去組織中的水分，使組織密度升高，離心時(shí)可以完全沉淀到試管底部，有利于后續(xù)操作；同時(shí)，硫酸鈉鹽析也可提高提取效率。Cannavan等根據(jù)基質(zhì)特點(diǎn)，分別用二氯甲烷提取肌肉中的DMZ，用甲苯提取肝臟和禽蛋中DMZ。用D-DMZ內(nèi)標(biāo)，回收率為93%～102%，CV為1.2%～7.7%，絕對(duì)回收率接近80%，但甲苯對(duì)MNZOH的提取效率很低。高小龍用無(wú)水硫酸鈉和二氯甲烷振蕩提取雞組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)中的MNZ和DMZ殘留。組織中DMZ及DMZOH的LOQ均為1.0μg/kg；肌肉平均回收率在56.9%～76.5%之間，肝臟在63.3%～72.6%之間，腎臟在64.2%～73.3%之間，脂肪在63.5%～75.7%之間；日內(nèi)CV均小于16%，日間CV均小于15%。

D. 其他溶劑提取

也有采用其他溶劑提取的報(bào)道。GB/T21318-2007測(cè)定豬肉、雞肉、牛肉、豬肝、雞肝、牛肝、豬腎、牛腎和魚肉中4-硝基咪唑、IPZ、MNZ、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑及其代謝物MNZOH、HMMNI時(shí)，樣品用硅藻土混勻，加飽和氯化鈉、甲醇-丙酮(3+1，v/v)，再均質(zhì)提取3min，離心后取上層液，LC-MS/MS測(cè)定。LOD達(dá)到0.5～1μg/kg，回收率為71.4%～115%。該提取過(guò)程類似于QuEChERS，相對(duì)較為簡(jiǎn)單。Semneiku等測(cè)定雞血中的MNZ和DMZ殘留，取1mL血清并加入20%的三氯乙酸甲醇溶液1mL，混合后離心，取上清液過(guò)濾膜后用高效液相色譜(HPLC)分析。血清中LOD為5ng/mL，回收率為82%～94%，CV小于10%。

2)超聲輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、高加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級(jí)效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的方法。UAE適用于勻漿的組織和結(jié)構(gòu)松散的樣品(如蜂蜜、牛奶)。GB/T21318-2007測(cè)定奶粉和蜂蜜中的4-硝基咪唑、IPZ、2-甲硝唑、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑殘留及其代謝物MNZOH、HMMNI時(shí)，用10mL飽和氯化鈉水溶液和70mL甲醇-丙酮(3+1，v/v)超聲波輔助提取30min，離心后取上層液體，經(jīng)固相萃取凈化，LC-MS/MS測(cè)定，LOD達(dá)到0.5～1μg/kg，回收率為71.4%～115%。

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