硝基咪唑類(lèi)藥物測(cè)定方法——液相色譜-質(zhì)譜法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(6)液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)

隨著LC與MS接口瓶頸解決，采用LC-MS技術(shù)測(cè)定硝基咪唑類(lèi)藥物的研究報(bào)道不斷增多，主要有熱噴霧電離源(TSI)、大氣壓化學(xué)電離源(APCI)和電噴霧電離源(ESI)三種離子化方式。LC-MS可分析GC-MS所不能分析的強(qiáng)極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物，但在測(cè)定中內(nèi)源性基質(zhì)引起的離子抑制效應(yīng)較為常見(jiàn)，通過(guò)改變質(zhì)譜條件、提高色譜分離效能、應(yīng)用合適的內(nèi)標(biāo)物可克服基質(zhì)效應(yīng)。

1)熱噴霧電離源(TSI)

TSI是最早應(yīng)用的LC-MS接口，但存在重復(fù)性差、定量效果差的缺點(diǎn)，現(xiàn)在已很少應(yīng)用。Cannavan等建立了禽組織和蛋中DMZ的LC-MS測(cè)定方法。色譜柱為ODS3(250mm×4mmi.d.)，流動(dòng)相為甲醇-0.05mol/L乙酸銨(1+1，v/v)，質(zhì)譜采用TSI離子源接口，離子源和四極桿溫度分別為250℃和100℃，SIM模式檢測(cè)。方法LOD小于1ng/g，回收率為93%～102%。

2)大氣壓化學(xué)電離源(APCI)

APCI借助電暈放電啟動(dòng)氣相離子化，形成單電荷的準(zhǔn)分子離子，適合測(cè)定極性較小的化合物。Sams等研究了液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-質(zhì)譜(LC-APCI-MS)方法檢測(cè)禽肉和蛋中DMZ、RNZ及其共同代謝物MNZOH。色譜柱為Prodigy ODS3柱(250mm×3.2mmid，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05mol/L乙酸銨(13+87，v/v)，流速0.5mL/min，電暈放電電壓3.22kV，高壓透射電壓(lensvoltage)0.0V，錐孔電壓10V，錐孔電壓偏移距5V，源溫140℃，APCI探針溫度500℃，正離子、SIM模式檢測(cè)，每種物質(zhì)檢測(cè)2個(gè)離子。方法LOD為0.1μg/kg(DMZ、RNZ)和0.5μg/kg(MNZOH)；平均回收率為65%(DMZ)、87%(RNZ)和75%(MNZOH)，RSD分別為22%、11%和14%。殷居易等采用LC-APCI-MS/MS方法對(duì)肉中MNZ、DMZ、TNZ、RNZ的殘留量進(jìn)行分析。采用Waters Sunfire C18色譜柱分離，流動(dòng)相為0.1%甲酸和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，APCI源正離子監(jiān)測(cè)，離子源霧化溫度450℃，碰撞氣(CAD)、氣簾氣(CUR)、霧化氣(NEB)流量分別為6mL/min、6mL/min、12mL/min，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。MNZ、DMZ、TNZ、RNZ的LOQ均0.2μg/kg，LOD為0.05μg/kg；豬、雞肉、小龍蝦去殼肉的平均回收率為73%～93%，日內(nèi)、日間RSD小于10%。

3)電噴霧電離源(ESI)

ESI適用于極性較大的化合物，也是目前硝基咪唑類(lèi)藥物L(fēng)C-MS分析采用最多的電離技術(shù)。Hurtaud-Pessel等建立了雞肉中MNZ、RNZ、DMZ和HMMNI等4種硝基咪唑類(lèi)藥物的液相色譜-電噴霧-單四極質(zhì)譜(LC-ESI-MS)分析方法。樣品用乙酸乙酯萃取，除脂后進(jìn)樣分析。色譜柱為Waters Symmetry C18(150×3.9mmi.d，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.2%甲酸(6+13+81，v/v)，流速0.6mL/min，ESI正離子、SIM模式檢測(cè)，RNZ-d3為內(nèi)標(biāo)定量。方法LOD在5μg/kg以下，回收率在73%～97%之間，CV為17%～26%。Zeleny等采用LC-ESI-MS/MS測(cè)定豬肉中6種硝基咪唑類(lèi)藥物。用C18(150mm×3mmi.d.5μm)色譜柱分離，以10mmol/L甲酸銨(pH3.5)-乙腈(90+10，v/v)和10mmol/L甲酸銨(pH3.5)-乙腈(10+90，v/v)為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.4mL/min，ESI+電離，源溫700℃，氣簾氣103.42kPa，噴霧氣和渦輪氣分別為344.74kPa、482.63kPa，噴霧電壓2000V，MRM檢測(cè)。方法回收率為101%～107%；CC和CCβ分別為0.29～0.44μg/kg和0.36～0.54μg/kg。黎翠玉等采用LC-ESI-MS/MS測(cè)定動(dòng)物肉中MNZ、DMZ和RNZ三種硝基咪唑類(lèi)化合物及兩種代謝物MNZOH、HMMNI殘留。色譜柱為AtlantisT3色譜柱(2.1mm×150mm，3μm)，流動(dòng)相為水-乙腈，梯度洗脫，流速0.25mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量2μL，ESI電離源，離子源溫度500℃，去簇電壓70V，入口電壓10V，出口電壓13V，錐孔反吹氣流量350L/h，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流750L/h，正離子掃描，MRM檢測(cè)。方法回收率在61.1%～108.0%之間，RSD為1.9%～6.3%，LOQ均為0.1μg/kg。Xia等還報(bào)道超高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)測(cè)定豬腎中6種硝基咪唑藥物的方法。用Acquity BEHC18(50mm×2.1mmi.d，1.7μm)色譜柱分離，水-乙腈梯度洗脫，毛細(xì)管電壓2.8kV，離子源溫度110℃，去溶劑溫度350℃，ESI正離子、MRM模式檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)定量。方法LOD為0.005～0.5μg/kg，LOQ為0.1～0.5μg/kg，平均回收率為83%～111%，CV小于12%，每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間僅需要4min。

Mottier等采用同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了鮮蛋、肉和魚(yú)中DMZ、RNZ、MNZ和IPZ等4個(gè)硝基咪唑類(lèi)藥物以及羥基代謝物MNZOH和IPZOH。色譜柱為Symmetry Shield C18 (15cm×2.1mm，3.5um)，0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.3mL/min，進(jìn)樣量30μL，Turbolon噴霧氣和氣簾氣均為氮?dú)猓魉?.5L/min和10mL/min，離子源溫度350℃，毛細(xì)管電壓1.2kV，去簇電壓20V，ESI電離，MRM檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。方法CCa為0.07～0.36μg/kg，CCβ為0.11～0.60μg/kg；鮮蛋、肌肉和加工蛋中的回收率為88%～111%。Xia等測(cè)定肌肉和禽蛋中MNZ、DMZ、RNZ和HMMNI殘留。采用C8色譜柱分離，流動(dòng)相為0.2%乙酸和乙腈，梯度洗脫，

LC-MS/MS檢測(cè)，ESI+、MRM模式測(cè)定。禽蛋的回收率為50%～86%，LOD為0.05～0.25μg/kg；雞肉回收率為66%～115%，LOD為0.07～0.27μg/kg；豬肉回收率為79%～11%，LOD為0.07～0.26μg/kg。

丁濤等用LC-MS/MS測(cè)定蜂王漿中MNZ、DMZ和RNZ殘留。使用氫氧化鈉溶液溶解樣品，以乙酸乙酯提取后測(cè)定。采用Waters symmetry C18色譜柱(15mm×2.1mm.i.d.，5μm)分離，5mmol/L醋酸銨溶液和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，ESI電離源，正離子檢測(cè)，源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓(SID)10V，第一重四極桿分辨率(Q1)為0.4，利用高選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(H-RSM)技術(shù)降低了基質(zhì)干擾，氘代二甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)定量，增加了定量的準(zhǔn)確性。DMZ的LOD為1.0μg/kg，LOQ為2.0μg/kg；MNZ和RNZ的LOD為0.5μg/kg，LOQ為1.0μg/kg；方法回收率為96.6%～110.6%，RSD為2.1%～7.4%。Sakamoto等采用反相C18色譜柱分離，甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，ESI+-MS/MS在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式下檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)(DMZ-d3、MNZ-C2，N2和RNZ-d3)定量，測(cè)定了蜂蜜和魚(yú)肉中MNZ、DMZ和RNZ。平均回收率為91.2%～107.0%，LOD為0.05～0.2μg/kg。Cronly等用LC-ESI-MS/MS測(cè)定牛奶和蜂蜜中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ及其羥基代謝物(MNZOH、HMMNI和IPZOH)，以及ORZ、TNZ、CNZ和TIZ等共11種硝基咪唑類(lèi)藥物。色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18(100mm×2mm，1.8μm)，柱溫45℃，流動(dòng)相為0.1%甲酸和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，流速0.5mL/min，MS/MS采用ESI模式檢測(cè)。奶樣品的CCa和CCβ分別為0.41～1.55μg/L和0.70～2.64ug/L，蜂蜜樣品分別為0.38～1.16μg/kg和0.66～1.98μg/kg。GB/T20744-2006也采用反相HPLC，乙腈-甲酸溶液為流動(dòng)相，串聯(lián)質(zhì)譜在ESI+、MRM模式下檢測(cè)蜂蜜中MNZ、DMZ和RNZ殘留。方法LOD為0.1～0.2μg/kg。

常見(jiàn)硝基咪唑類(lèi)藥物的LC-MS分析方法見(jiàn)表16-2。

表16-2 硝基咪唑類(lèi)藥物的LC-MS分析方法簡(jiǎn)表

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