聚醚類(lèi)藥物殘留測(cè)定方法（三）

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

(5)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是PEs最常用的殘留檢測(cè)方法，該方法具有較高的靈敏度和特異性。PEs的HPLC法可分為直接檢測(cè)法和衍生化檢測(cè)法。

1)直接檢測(cè)法

直接檢測(cè)法即未經(jīng)衍生化步驟的分析方法。LAS含酚甲酸熒光基團(tuán)，可直接使用熒光檢測(cè)器(FLD)測(cè)定，也可用紫外檢測(cè)器(UVD)測(cè)定，但由于靈敏度的原因，UVD多用于飼料和預(yù)混劑的測(cè)定。Weiss等首次建立了動(dòng)物組織中LAS的HPLC-FLD測(cè)定法。取10g肝臟組織，用乙腈提取，轉(zhuǎn)移部分提取上清液，用己烷洗滌脫脂后，在氮?dú)庀麓蹈?，用?jīng)1mL流動(dòng)相飽和的水復(fù)溶，再用2mL流動(dòng)相提取，供HPLC-FLD分析。色譜分析柱為Whatman Partisil 10 PXS 10/25 柱(25cm× 4.6mm，10um)，流動(dòng)相為四氫呋喃-甲醇-氫氧化銨-己烷(150+30+10+810，v/v) 的上清液和四氫呋喃-甲醇-己烷(150+30+820，v/v)按體積比3：1組成，等度洗脫，流速2mL/min，F(xiàn)LD測(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為430nm。該方法LOD為25μg/kg，回收率在70%以上。Kaykaty等建立了牛、雞、狗、大鼠及小鼠血液中LAS的HPLC-FLD直接檢測(cè)方法。用乙酸乙酯提取LAS，60℃下氮?dú)獯蹈商崛∫?，HPLC流動(dòng)相復(fù)溶，HPLC分析柱為Partisil P×S 5/25硅膠柱(25cm，5um)，流動(dòng)相為己烷-四氫呋喃-甲醇-三乙胺-氨水(810+140+20+20+10，v/v)，流速為0.9mL/min，F(xiàn)LD激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為430nm。在5μg/kg～5mg/kg范圍內(nèi)，平均添加回收率為84%，CV為4%～8%，線性范圍為3.0～500ng/mL。

2)柱前衍生法

除LAS外，其他PEs均無(wú)發(fā)色基團(tuán)，在紫外吸收光譜中呈末端吸收(210～220nm)，用常規(guī)HPLC法難以直接測(cè)定。但其結(jié)構(gòu)中含有眾多的活性基團(tuán)，如羧基、羥基、酮基、縮醛和半縮醛等，可供紫外或熒光衍生化。紫外衍生化方法常采用吡啶重鉻酸鹽(PDC)衍生化法，熒光衍生化方法常采用9-蒽重氮甲烷(ADAM)衍生化法和1-溴乙酰芘(1-BAP)衍生化法。

A.吡啶重鉻酸鹽(pyridinium dichromate，PDC)衍生化

Dimenn等采用柱前衍生HPLC法測(cè)定了雞皮膚、脂肪中SAL殘留。用甲醇提取，提取液中加入四氯化碳LLP凈化，再用硅膠柱和C18柱凈化，凈化后的SAL洗脫液在氮?dú)庀麓蹈?，用二氯甲烷?fù)溶后與10mg PDC混合，室溫振蕩30min進(jìn)行衍生化反應(yīng)，加入1mL 5%碳酸氫鈉和1 mL二氯甲烷，振蕩，去除水層，將二氯甲烷層用1mL 5%碳酸氫鈉洗滌4次，用1 mL水洗1次。將二氯甲烷層用無(wú)水硫酸鈉干燥后，過(guò)硅膠柱(0.2g) 凈化，HPLC測(cè)定。流動(dòng)相為水-四氫呋喃-磷酸-乙腈(60+40+0.1+900，v/v)，色譜分析柱為Altex Ultrasphere ODS柱(25cm×4.6cm)，流速為2.0 mL/min，UVD在225nm檢測(cè)。該方法LOD為0.1mg/kg，回收率在94%～ 102.1%之間。

B.9-蒽重氮甲烷(9-anthryldiazomethane， ADAM)衍生化

Takatsuki等建立了雞組織中MON的HPLC-FLD檢測(cè)法。用甲醇-水(8+2，v/v)提取雞組織中的MON，用氯仿和水LLP凈化，經(jīng)硅膠SPE柱凈化后，40～45℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，2mL甲醇復(fù)溶，將其加入30 mL 0℃的0.1 mol/L KH2PO4(pH3.0)溶液中混合，酸化處理5 min后再用氯仿LLE溶液中的藥物，40～45℃下旋轉(zhuǎn)蒸干有機(jī)層，2mL甲醇復(fù)溶。加0.5 mL 10 umol/mL的ADAM溶液，室溫、避光、過(guò)夜進(jìn)行衍生化反應(yīng)，40℃旋轉(zhuǎn)蒸干后用2mL二氯甲烷復(fù)溶，過(guò)硅膠柱凈化后，用正相HPLC-FLD測(cè)定。色譜分析柱為Nova-PakC18柱(30cm×3.9mm)，流動(dòng)相為二氯甲烷-甲醇(19+1，v/v)，流速1.0mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)412nm。方法的添加回收率在47%～78%之間，CV在1.8%～7.1%之間，LOD為1μg/kg。

C.1-溴乙酰芘(l-bromoacetylpyrene，1-BAP)衍生化

宮川弘之等建立了同時(shí)檢測(cè)雞組織中MON和SAL的殘留分析方法。組織中的SAL和MON用乙腈提取，提取液用乙酸乙酯和水進(jìn)行LLP凈化，取乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈珊笥寐确聫?fù)溶，再過(guò)硅膠SPE柱凈化，洗脫液氮?dú)獯蹈?，?mL 0.2%的1-BAP乙腈溶液，再加100μL 2%的Kryptofix 222乙腈溶液催化，在50℃下反應(yīng)90min，使SAL和MON生成熒光衍生物，再加入10mL氯仿，過(guò)Sep-pak弗羅里硅土柱凈化后，用HPLC-FLD測(cè)定。色譜柱為L(zhǎng)-column ODS(250nm×4.6mm)，流動(dòng)相為甲醇-水(96+4，v/v)，柱溫40℃，流速1.0mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm。方法添加回收率在66.2%～96.2%之間，LOD為50μg/kg。

3)柱后衍生法

盡管PEs有多種衍生化方法，但由于靈敏度不夠、過(guò)程繁瑣等原因使其應(yīng)用受到一-定限制，而柱后衍生法具有一定的優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物源基質(zhì)中PEs的柱后衍生HPLC檢測(cè)中主要為芳香醛衍生化法。Gerhardt等建立了動(dòng)物組織中MON、SAL和NAR的HPLC檢測(cè)法。用異辛烷-乙酸乙酯(9+1，v/v)提取藥物，過(guò)硅膠SPE柱凈化后，HPLC檢測(cè)。色譜分析柱為Intersil ODS-2柱(250mm×3.2mm，5um)，流動(dòng)相為甲醇-0.01mol/L乙酸銨(94+6，v/v，pH4.0)，流速為0.5mL/min。柱后衍生化試劑香草醛當(dāng)日配制，將9.5g 99%的香草醛溶于127.5mL冷甲醇-硫酸(125+2.5，v/v)中配成。衍生反應(yīng)溫度為100℃，流速0.3mL/min。UVD檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm。NAR、SAL的LOD為5μg/kg，MON為2ug/kg，所有藥物的LOQ均為5μg/kg；MON、SAL和NAR的平均回收率分別為94.3%、97.2%和94.1%。Moran等建立了?？墒承越M織和奶中MON的HPLC-UVD方法。用甲醇-水(850+150，v/v)作為提取液，過(guò)Sep-Pak硅膠SPE凈化。色譜分析柱為Whatman Partisil ODS-3柱(25cm×4.6mm)，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸(940+60+1，v/v)，甲醇-硫酸-香草醛(95+2+3，v/v/w)進(jìn)行柱后衍生化(防止紫外照射)，流動(dòng)相和衍生化試劑的流速均為0.7mL/min，衍生反應(yīng)溫度為98℃。產(chǎn)物在520nm處檢測(cè)。奶和可食性組織的LOQ分別為5μg/kg和25μg/kg，回收率在80%～88%之間。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2001年發(fā)布的動(dòng)物源食品中MON和SAL的殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)4)，采用HPLC-柱后衍生-UVD法測(cè)定雞肌肉、脂肪、肝臟和腎臟中MON和SAL的殘留。試樣用異辛烷提取，經(jīng)硅膠SPE柱凈化后，HPLC測(cè)定。色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm，5um)，流動(dòng)相為甲醇-冰乙酸-水(94+3+3，v/v)，衍生液為香草醛溶液，流動(dòng)相和衍生液流速均為0.7mL/min，衍生反應(yīng)溫度為95℃，UVD檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm。MON和SAL的LOD分別為50μg/kg和100μg/kg；在100μg/kg添加濃度水平的回收率為80%～110%，批內(nèi)CV≤10%，批間CV≤15%。

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