硝基呋喃類代謝物最大允許殘留限量和分析技術(shù)——前處理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3)提取和凈化

NFs代謝物檢測(cè)過程中常用的樣品提取、凈化方法包括液液分配法(LLP)、固相萃取法(SPE)和沉淀法等，近年來超臨界流體萃取(SFE)、基質(zhì)固相分散技術(shù)(MSPD)等也有應(yīng)用。

1)沉淀法(precipitation)

對(duì)于奶粉、蛋粉等高蛋白、高脂肪樣品，在水解、衍生化蛋白結(jié)合態(tài)硝基呋喃代謝物后，可加入蛋白質(zhì)沉淀劑ZnSO4和K4Fe(CN)6，有效去除奶粉、蛋粉中的蛋白，避免提取、凈化過程中的乳化、膠化現(xiàn)象。彭濤等22用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。鹽酸水解奶粉中蛋白結(jié)合的代謝物，同時(shí)加入2-硝基苯甲醛，37℃過夜衍生化。加入ZnSO4，調(diào)至pH7.0后，再加入K4Fe(CN)6去除蛋白。然后用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，分析物采用電噴霧電離(ESI)正離子、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。在添加濃度0.5～2μg/kg范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法回收率為89.5%～110.3%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于11.3%；AMOZ、AOZ方法LOD為0.05ug/kg，SEM、AHD為0.1μg/kg。

對(duì)于蜂王漿樣品，三氯乙酸是一種很好的蛋白沉淀劑，同時(shí)其較強(qiáng)的酸性又可以提供合適的酸性反應(yīng)環(huán)境。丁濤等報(bào)道了LC-MSMS測(cè)定蜂王漿中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮4種NFs代謝物殘留的方法。以三氯乙酸作為蜂王漿的蛋白質(zhì)沉淀劑，同時(shí)提供衍生化反應(yīng)所需的酸性環(huán)境。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH7～7.5時(shí)，AHD、AOZ、SEM和AMOZ代謝物的衍生產(chǎn)物提取效率最高，分別為92.1%、95.1%、91.4%和94.3%。在不同的pH條件下，4種代謝物的衍生產(chǎn)物的萃取效率影響不一樣。對(duì)于AHD而言，當(dāng)pH8～10時(shí)，萃取效率極低；對(duì)于AMOZ而言，當(dāng)pH3～5時(shí)，完全不能將其從水相中提取至有機(jī)相中。AOZ和SEM對(duì)pH的敏感程度不是很高，但是在弱堿性條件下(pH7～7.5)，提取效率最高。因此，在進(jìn)行提取步驟的時(shí)候，需要進(jìn)行比較準(zhǔn)確的pH調(diào)節(jié)，才可以最大限度地提取4種代謝物的衍生產(chǎn)物。

2) 液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

NFs代謝物的LLP，一般是在pH7的水溶液中與乙酸乙酯進(jìn)行兩相分配。但這種方法有時(shí)出現(xiàn)乙酸乙酯和水相分層不徹底的情況，易產(chǎn)生干擾，從而影響回收率。特別是對(duì)高蛋白、高脂肪、高淀粉的樣品，可加入少量的十二烷基磺酸鈉以緩解乳化現(xiàn)象。為達(dá)到更好的凈化效果，也常采用正己烷對(duì)提取液做進(jìn)一步凈化。

Lopez等應(yīng)用10%氯化鈉溶液來溶解蜂蜜，離心之后取上清液過OasisHLB固相萃取柱，用洗脫液進(jìn)行水解和衍生化反應(yīng)。調(diào)節(jié)pH7.15～7.25之后，用正己烷L(zhǎng)LP除脂，然后再用乙酸乙酯LLP。有機(jī)相濃縮后用甲醇和水復(fù)溶，過0.2um的PTFE濾膜完成樣品的前處理。Rodziewicz建立了牛奶中NFs代謝物的LC-MS方法。牛奶樣品經(jīng)離心(3500r/min，10min，4℃)去除上層脂質(zhì)層后進(jìn)行水解衍生化，冷卻至室溫后，加入磷酸鈉和NaOH調(diào)節(jié)pH，再用乙酸乙酯進(jìn)行LLP，收集有機(jī)相蒸干并復(fù)溶于流動(dòng)相中，過濾膜后上LC-MS/MS檢測(cè)。

同時(shí)，樣品溶液的pH對(duì)萃取效率有很大的影響。丁濤等試驗(yàn)了不同pH對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)pH在7.0～7.5時(shí)，AHD、AOZ、SEM、AMOZ衍生化產(chǎn)物的提取效率最高，分別為92.1%、95.1%、91.4%、94.3%。

3) 固相萃取法(solidphaseextraction，SPE)

SPE廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織樣品中NFs代謝物的凈化。主要有基于反相保留原理的C18、HLB、EN、CN柱，基于離子交換原理的MAX柱等，多種原理的串聯(lián)柱、復(fù)合用柱也被大量采用，顯著提高了凈化效果。

彭濤等對(duì)普通C18SPE柱和以乙烯吡咯烷酮-_二乙烯基苯共聚物為吸附劑的OasisHLBSPE柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)后者對(duì)分析物有很強(qiáng)的選擇性保留，而大多數(shù)基質(zhì)干擾物則保留較弱。共聚物吸附劑可能通過π-π作用而使硝基芳烴衍生物保留。Hormazabal等應(yīng)用85%三氯乙酸來提取豬肉中的NFs代謝物，正己烷L(zhǎng)LP除脂，然后進(jìn)行衍生化反應(yīng)，選擇OasisHLB柱進(jìn)行凈化，乙腈-水(70+30，v/v)作為洗脫液進(jìn)行洗脫，而后加入--定體積的三氯甲烷從洗脫液中萃取出目標(biāo)化合物，經(jīng)離心去除水相，轉(zhuǎn)移有機(jī)相后蒸干，復(fù)溶于水中，過濾膜后用LC-MS檢測(cè)。龐國(guó)芳等應(yīng)用LiChrolutEN柱對(duì)禽肉中經(jīng)過水解和衍生化的NFs代謝物進(jìn)行凈化，采取pH7.4的緩沖液淋洗SPE柱，再用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，氮?dú)獯蹈珊笥昧鲃?dòng)相進(jìn)行復(fù)溶，最后用儀器測(cè)定。該方法重點(diǎn)研究了不同處理步驟對(duì)結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)衍生化后反應(yīng)溶液調(diào)pH并用乙酸乙酯提取兩次，這種方法有時(shí)會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，乙酸乙酯和水相分層不徹底，易產(chǎn)生干擾，從而影響回收率。另一方面則是比較4種不同的SPE柱的凈化效果和回收率：OasisMAX(60mg，3mL，Waters)、OasisHLB(60mg，3mL，Waters)、C18(500mg，3mL，J.T.Baker)、LiChrolutEN(200mg，3mL，Merck)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LiChrolutEN柱的凈化效果和回收率優(yōu)于另外三種SPE柱。林黎明等比較了MAX、HLB復(fù)合柱法、ENSPE單柱法、HLB單柱法和乙酸乙酯LLP方法，比較了甲醇-乙酸洗脫液和乙酸乙酯洗脫液的效果，最終確定主要采用的提取和凈化步驟是：對(duì)于肉類組織采用ENSPE柱凈化，乙酸乙酯洗脫；對(duì)于肝、蝦等易產(chǎn)生高度混濁濾液的樣品則先采用乙酸乙酯提取，再用ENSPE柱凈化。實(shí)驗(yàn)表明，MAX、HLB復(fù)合柱法操作較繁，并要求嚴(yán)格控制洗脫液的pH；而單純采用LLP法，對(duì)某些復(fù)雜樣品凈化效果不佳。實(shí)驗(yàn)研究了在樣品處理過程中添加適量硅藻土，與樣品同時(shí)研磨，改變其黏稠性，再進(jìn)行水解，可明顯提高凈化效果，回收率可達(dá)70%～95%，實(shí)驗(yàn)表明HLB柱與EN柱有同樣的效果。

王媛等提取水產(chǎn)品中的NFs代謝物，為了去除提取物中的水溶性雜質(zhì)，采取LLP的方法，將被測(cè)物萃取到有機(jī)相中，進(jìn)行初步凈化。將衍生化之后的上清液調(diào)至pH7.0左右，然后用30mL乙酸乙酯分兩次萃取，可以達(dá)到良好的效果。進(jìn)一步的凈化采用C18-CN混合柱，洗脫SPE柱時(shí)，比較了2mL甲醇和5mL乙酸乙酯對(duì)4種組分的洗脫效果。用5mL乙酸乙酯洗脫時(shí)，AMOZ的回收率偏低，僅為50%，其他3個(gè)組分可以滿足殘留檢測(cè)要求，回收率在90%～110%；采用2mL甲醇洗脫，各組分的回收率都高于80%，但甲醇用量過大也會(huì)使雜質(zhì)與目標(biāo)化合物一起被洗脫出來。Conneely等建立了動(dòng)物肝臟組織中NFs代謝物的LC-MS/MS方法。絞碎勻漿的肝臟組織經(jīng)甲醇和水洗滌，然后再依次經(jīng)預(yù)冷的甲醇、乙醇和乙醚洗滌，離心后保留下層固相樣品，加入鹽酸溶液和酶進(jìn)行水解和衍生化反應(yīng)，經(jīng)乙酸乙酯提取三次后用氮?dú)獯蹈?，?fù)溶于Tris緩沖液中(pH6.3)，然后用兩種串聯(lián)的SPE柱純化。先用OasisMAX柱凈化，以甲醇、水和Tris緩沖液(pH6.3)進(jìn)行活化，隨后用2%氨水淋洗，甲醇進(jìn)行洗脫。洗脫液用氮吹濃縮后復(fù)溶于水中。第二級(jí)凈化柱為OasisHLB，用甲醇和水進(jìn)行活化，50%的甲醇溶液(含2%的乙酸)進(jìn)行洗滌，之后應(yīng)用90%的甲醇溶液(含2%的氨水)洗脫衍生化代謝物。洗脫液氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶于水-乙腈(2+1，v/v)溶液中，過濾膜后LC-MS/MS分析。肝臟樣品的分析相對(duì)更為困難，容易產(chǎn)生干擾和嚴(yán)重的離子抑制現(xiàn)象，串接的SPE方法純化樣品并保證了回收率，是處理復(fù)雜基質(zhì)樣品的有效手段。

4)超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE具有高效快速、節(jié)約溶劑等優(yōu)點(diǎn)，但是需要在專門的儀器中才能實(shí)現(xiàn)。Arancibia等利用SFE技術(shù)來提取、凈化尿液中的呋喃妥因及其代謝物。使用SFE-400超臨界萃取裝置，10mL的不銹鋼管作為提取柱，熔融的石英管作為限流裝置，乙腈作為修飾劑，乙腈-CO2混合提取液的流動(dòng)速度為0.5mL/min，壓力為2500psi，爐溫和限流器的溫度為80℃，萃取時(shí)間為20min。萃取液采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器(HPLC-UVD)在310nm測(cè)定。呋喃妥因的線性范圍為10.9～378.0umol/L(R=0.9995)，其代謝物為3.0×103～21.0umol/L(R=0.9992)；檢測(cè)限分別為12.1umol/L和0.9umol/L。

5)加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)

安強(qiáng)等建立了利用ASE-HPLC快速測(cè)定動(dòng)物源食品中NFs代謝產(chǎn)物的方法。稱取已搗碎的樣品10.0g，與20g硅藻土混合均勻，填入33mL的萃取池中，萃取池放入ASE儀的加熱爐腔內(nèi)，在設(shè)定的萃取條件下完成萃取過程。作者優(yōu)化了萃取溶劑、萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間等條件。最佳萃取溶劑為體積比1：1的甲醇-三氯乙酸(0.68mol/L)，最佳萃取溫度100℃，最佳萃取壓力1.0×107Pa，最佳萃取時(shí)間10min×3次。萃取液冷卻過濾后，用鄰氯苯甲醛衍生化，NaOH調(diào)至pH7.0，乙酸乙酯LLP，再過C18-CN混合SPE柱凈化，用HPLC-UVD檢測(cè)。方法LOD(S/N=3)為：SEM 0.005μg/mL，AHD 0.005μg/mL，AMOZ 0.005μg/mL，AOZ 0.005μg/mL；添加濃度5.0mg/kg時(shí)的回收率分別為：SEM88.6%±3.8%，AHD82.9%±4.9%，AMOZ89.3%±3.9%，AOZ93.7%±3.8%。Tao等利用ASE和超聲波加速衍生技術(shù)建立了鯉魚和黃鱔中4種NFs代謝物的測(cè)定方法。采用ASE提取分析物，超聲波中衍生反應(yīng)1h，再用SPE進(jìn)行凈化。方法的CCa在0.07～0.13μg/kg之間，CCβ在0.31～0.49μg/kg之間，方法回收率為77.2%～97.4%。與傳統(tǒng)方法相比，該方法大大縮短了前處理時(shí)間。

6)固相支撐液液萃取(solid-supported-liquid-liquidextraction，SSLLE)

祝偉霞等采用硅藻土SSLLE和平行蒸發(fā)聯(lián)用前處理技術(shù)進(jìn)行凈化和富集，建立了雞肉、蜂蜜、牛奶中呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、呋喃妥因代謝物(AHD)和呋喃西林代謝物(SEM)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)確證方法。NFs代謝物經(jīng)衍生化后，采用超高效1.7μm C18柱分離4種待測(cè)物，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。AOZ和AMOZ的最低檢測(cè)限為0.1μg/kg，AHD和SEM為0.25μg/kg；3個(gè)不同添加水平時(shí)該方法回收率為85.6%～104.3%，RSD為3.2%～9.5%。樣液在柱中的平衡時(shí)間是影響回收率的重要參數(shù)，該研究分別測(cè)定不同平衡時(shí)間對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果表明30min時(shí)溶液能與硅藻土填料形成牢固的支撐作用。同時(shí)優(yōu)化了不同體積乙酸乙酯的萃取效率，20mL乙酸乙酯回收率為85%，40mL乙酸乙酯在重力作用下能完全萃取固相萃取柱中4種NFs代謝物。

7)基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

曹文卿等采用MSPD技術(shù)，經(jīng)LLP凈化，同位素內(nèi)標(biāo)定量，建立了蛋黃粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮等NFs代謝物殘留的LC-MS/MS測(cè)定方法。利用硅藻土為基質(zhì)分散劑對(duì)蛋黃粉進(jìn)行基質(zhì)分散，三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提供水解環(huán)境，2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯LLP等前處理手段對(duì)蛋黃粉中的NFs代謝產(chǎn)物進(jìn)行了提取和凈化。該方法LOQ為0.5μg/kg，線性范圍為0.5～6.0μg/kg，室內(nèi)驗(yàn)證回收率范圍為90.06%～109.8%，RSD為2.0%～7.7%。該方法適用于殘留檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)蛋黃粉類基質(zhì)中NFs代謝產(chǎn)物的監(jiān)控檢測(cè)。

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