牛奶和奶粉中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定
牛奶和奶粉中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定
[db:作者] / 2022-12-13 00:008.2.3.1 適用范圍
適用于牛奶和奶粉中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。方法檢出限:牛奶中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮為1μg/kg,奶粉中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮為5μg/kg。
8.2.3.2 方法原理
試樣在pH5.0條件下加酶水解,乙腈-乙酸乙酯提取,凝膠色譜凈化,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,外標(biāo)法定量。
8.2.3.3 試劑和材料
乙腈、乙酸乙酯、環(huán)已烷、甲醇、乙酸均為液相色譜純;乙酸鈉:分析純;無水硫酸鈉:分析純:經(jīng)650℃灼燒4h,置于干燥器內(nèi)備用。
β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶:β-glucuronidase/arylsulfatase,100000unit/mL。
0.02mol/L乙酸鈉緩沖液(pH=5.0):稱取無水乙酸鈉0.82g溶于500mL水中,用乙酸調(diào)節(jié)pH=5.0。甲醇溶液(7+3,v/v):30體積的水與70體積的甲醇混勻。乙酸乙酯-環(huán)己烷(1+1,v/v):50體積的乙酸乙酯與50體積的環(huán)己烷混勻。
a-群勃龍、β-群勃龍(β-trenbolone,CAS:10161-33-8)、19-乙烯去甲睪酮(nortestosterone,CAS:434-22-0)和epi-19-乙烯去甲睪酮(epi-nortestosterone,CAS:4409-34-1)標(biāo)準(zhǔn)品:純度大于或等于98%。
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別精確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。
混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液:取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1mL至100mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,濃度為1ug/mL。
8.2.3.4 儀器和設(shè)備
高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源(ESI)。凝膠色譜儀。分析天平:感量0.1mg和0.01g。離心機(jī)。恒溫水浴搖床。渦旋混合器。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
8.2.3.5 樣品前處理
(1) 試樣制備
a.牛奶取均勻樣品約250g裝入潔凈容器作為試樣,密封置4℃下保存,并標(biāo)明標(biāo)記。
b.奶粉取均勻樣品約250g裝入潔凈容器作為試樣,密封,并標(biāo)明標(biāo)記。
(2) 提取
牛奶樣品稱取約5g(準(zhǔn)確至0.01g)于50mL具塞離心管中,奶粉樣品稱取約1g(準(zhǔn)確至0.01g)并加入5mL水于50mL具塞離心管中,混勻。
在稱取好樣品的離心管中加入5mL乙酸鈉緩沖液和20μL β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,搖勻后蓋好塞子置于恒溫水浴搖床上,37℃振蕩水解過夜。待水解液冷卻至室溫后,首先加入5mL乙腈,振搖,以沉淀蛋白,然后再加入20mL乙酸乙酯,蝸旋振蕩提取2min后,3000r/min離心10min,移取上清液通過5g無水硫酸鈉過濾至雞心瓶中。再用20mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次,合并上清液于同一雞心瓶中。
(3)凈化
1)凝膠色譜條件
凈化柱:22gS-X3 Bio-Beads填料,200mm×25mm(內(nèi)徑)或相當(dāng)者:流動(dòng)相:乙酸乙酯-環(huán)已烷,流速:5.0mL/min;定量環(huán):5mL;凈化程序:0~10min棄去洗脫液,10~15.5min收集洗脫液。
2)凝膠色譜凈化
將提取液在45℃下蒸至近干,用乙酸乙酯-環(huán)已烷(50+50,v/v)定容至10mL的玻璃試管中,按上述條件凈化。凈化后將收集的洗脫液蒸干,用1mL甲醇-水旋渦振蕩溶解,過0.45μm濾膜供HPLC-MS/MS分析。
(4)空白基質(zhì)溶液的制備
將取牛奶陰性樣品Sg,奶粉陰性樣品1g(精確到0.01g),按上述提取凈化步驟操作。
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