牛奶和奶粉中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.2.3.1 適用范圍

適用于牛奶和奶粉中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。方法檢出限：牛奶中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮為1μg/kg，奶粉中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮為5μg/kg。

8.2.3.2 方法原理

試樣在pH5.0條件下加酶水解，乙腈-乙酸乙酯提取，凝膠色譜凈化，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。

8.2.3.3 試劑和材料

乙腈、乙酸乙酯、環(huán)已烷、甲醇、乙酸均為液相色譜純；乙酸鈉：分析純；無水硫酸鈉：分析純：經(jīng)650℃灼燒4h，置于干燥器內(nèi)備用。

β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶：β-glucuronidase/arylsulfatase，100000unit/mL。

0.02mol/L乙酸鈉緩沖液(pH=5.0)：稱取無水乙酸鈉0.82g溶于500mL水中，用乙酸調(diào)節(jié)pH=5.0。甲醇溶液(7+3，v/v)：30體積的水與70體積的甲醇混勻。乙酸乙酯-環(huán)己烷(1+1，v/v)：50體積的乙酸乙酯與50體積的環(huán)己烷混勻。

a-群勃龍、β-群勃龍(β-trenbolone，CAS：10161-33-8)、19-乙烯去甲睪酮(nortestosterone，CAS：434-22-0)和epi-19-乙烯去甲睪酮(epi-nortestosterone，CAS：4409-34-1)標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于或等于98%。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液：取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1mL至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度為1ug/mL。

8.2.3.4 儀器和設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。凝膠色譜儀。分析天平：感量0.1mg和0.01g。離心機(jī)。恒溫水浴搖床。渦旋混合器。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

8.2.3.5 樣品前處理

(1) 試樣制備

a.牛奶取均勻樣品約250g裝入潔凈容器作為試樣，密封置4℃下保存，并標(biāo)明標(biāo)記。

b.奶粉取均勻樣品約250g裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。

(2) 提取

牛奶樣品稱取約5g(準(zhǔn)確至0.01g)于50mL具塞離心管中，奶粉樣品稱取約1g(準(zhǔn)確至0.01g)并加入5mL水于50mL具塞離心管中，混勻。

在稱取好樣品的離心管中加入5mL乙酸鈉緩沖液和20μL β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，搖勻后蓋好塞子置于恒溫水浴搖床上，37℃振蕩水解過夜。待水解液冷卻至室溫后，首先加入5mL乙腈，振搖，以沉淀蛋白，然后再加入20mL乙酸乙酯，蝸旋振蕩提取2min后，3000r/min離心10min，移取上清液通過5g無水硫酸鈉過濾至雞心瓶中。再用20mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并上清液于同一雞心瓶中。

(3)凈化

1)凝膠色譜條件

凈化柱：22gS-X3 Bio-Beads填料，200mm×25mm(內(nèi)徑)或相當(dāng)者：流動(dòng)相：乙酸乙酯-環(huán)已烷，流速：5.0mL/min；定量環(huán)：5mL；凈化程序：0～10min棄去洗脫液，10～15.5min收集洗脫液。

2)凝膠色譜凈化

將提取液在45℃下蒸至近干，用乙酸乙酯-環(huán)已烷(50+50，v/v)定容至10mL的玻璃試管中，按上述條件凈化。凈化后將收集的洗脫液蒸干，用1mL甲醇-水旋渦振蕩溶解，過0.45μm濾膜供HPLC-MS/MS分析。

(4)空白基質(zhì)溶液的制備

將取牛奶陰性樣品Sg，奶粉陰性樣品1g(精確到0.01g)，按上述提取凈化步驟操作。

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