牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量分析條件的選擇

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.2.7 分析條件的選擇

(1) 試樣制備

牛尿?yàn)橐后w樣品，可直接取10mL牛尿于50mL離心管中，3000r/min離心15min后，將尿液中少量懸浮物沉淀，取3mL上清液，加入含有玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代內(nèi)標(biāo)物的試管中，渦旋30s溶解混勻，即可。

(2)免疫親和柱凈化

本方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)了Euroclone公司和Randox公司兩種免疫親和柱。Euroclone公司的免疫親和柱對(duì)玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素同時(shí)吸附，操作較為簡(jiǎn)單，但由于該柱的柱容量較小(玉米赤霉醇10ng，己烯雌酚10ng，己烷雌酚5ng，雙烯雌酚5ng)，用于多組分分析回收率的重現(xiàn)性較差。Randox公司的免疫親和柱分為玉米赤霉醇凈化柱和二苯乙烯類激素凈化柱兩種，該柱操作較前者略復(fù)雜，但柱容量較大(玉米赤霉醇100ng，己烯雌酚50ng，己烷雌酚50ng，雙烯雌酚50ng)，檢測(cè)靈敏度高，回收率重現(xiàn)性較好。因此，最終本實(shí)驗(yàn)選擇了Randox公司的免疫親和柱。柱平衡、淋洗和被測(cè)物的洗脫，所用溶液以及流速控制，均按照Randox公司試劑盒中提供的使用操作說明書執(zhí)行。

(3)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進(jìn)樣方式，以5μL/min將玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入串聯(lián)質(zhì)譜的離子源中。一級(jí)質(zhì)譜分析(Q1，母離子掃描)比較了電噴霧電離(ESI)的正方式和負(fù)方式，4種被測(cè)物均在負(fù)方式條件下得到了較高的響應(yīng)值，確定了準(zhǔn)分子離子峰(M-1)，優(yōu)化了去簇電壓(DP)。對(duì)被測(cè)物的準(zhǔn)分子離子碰撞后，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(MS2，子離子掃描)，得到子離子質(zhì)譜圖，見圖9-3。對(duì)每種被測(cè)物選定的子離子進(jìn)行碰撞氣能量(CE)的優(yōu)化。在連接了液相色譜儀后，嘗試采用大氣壓化學(xué)電離(APCI)負(fù)方式進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)APCI(-)電離方式檢測(cè)靈敏度更高些。通過對(duì)APCI(-)條件下離子源溫度、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣1壓力、噴霧器電流等參數(shù)優(yōu)化，以優(yōu)化后本方法提供的參數(shù)對(duì)被測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)，玉米赤霉醇和己烷雌酚的方法最低檢出限可達(dá)0.25μg/kg，己烯雌酚和雙烯雌酚的方法檢出限為0.5μg/kg，可滿足日常檢測(cè)和殘留監(jiān)控的玉米赤霉醇為0.5μg/kg，二苯乙烯類激素殘留為1μg/kg要求。

(4)HPLC條件的優(yōu)化

玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素多采用C18柱進(jìn)行分離，也有用C8柱的報(bào)道，但采用LC-MS-MS分析時(shí)，更多關(guān)注的是柱效和檢出限，而對(duì)分離度不作為重點(diǎn)。先后試用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多個(gè)品牌的C18和C8柱，經(jīng)比較Agilent公司的ZORBAXSB C8 (150mm×4.6mm，3.5um)對(duì)玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素的分析效果更好一些。

采用APCI電離時(shí)，乙腈為首選流動(dòng)相，流速1mL/min。在此前提下試驗(yàn)了不同流動(dòng)相比例和梯度程序。由于流速較高，乙腈比例不宜低，最終選定乙腈-水=70+30。對(duì)比了不同梯度洗脫程序的分離結(jié)果，沒有明顯改善，因而選定了固定比例流動(dòng)相。

9.2.2.8 線性范圍和檢測(cè)低限

配制玉米赤霉醇、己烷雌酚的濃度分別為1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL，己烯雌酚、雙烯雌酚的濃度分別為2.5ng/mL、5.0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以本方法的測(cè)試條件，進(jìn)樣50μL進(jìn)行測(cè)定，用經(jīng)過內(nèi)標(biāo)校正的峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各被測(cè)組分的濃度作圖，其各目標(biāo)物在檢測(cè)范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系，線性方程和相關(guān)系數(shù)見表9-9。由于被測(cè)物均為禁用獸藥，因此，實(shí)驗(yàn)以最低檢測(cè)限(MRL)的1/2為最低檢測(cè)，10倍的MRL為上限進(jìn)行檢測(cè)。從表9-9數(shù)據(jù)可知，在此范圍被測(cè)物含量與質(zhì)量色譜峰面積呈線性關(guān)系。

9.2.2.9 方法回收率和精密度

用不含玉米赤霉醇和己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚的牛尿樣品做添加回收和精密度試驗(yàn)，樣品添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)后，按本方法進(jìn)行樣品制備、凈化和測(cè)定，分析結(jié)果見表9-13。由表9-13結(jié)果看到，在相當(dāng)方法檢出限0.25/0.50μg/kg，回收率為62.9%～117.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為13.67%～21.63%；在方法限量0.5/1.0μg/kg，回收率為65.5%～119%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為13.42%～24.19%。

表9-13 4種激素添加回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(n=10)

9.2.2.10 重復(fù)性和再現(xiàn)性

在重復(fù)性試驗(yàn)條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過重復(fù)性限(r)，如果差值超過重復(fù)性限(r)，應(yīng)舍棄試驗(yàn)結(jié)果并重新完成兩次單個(gè)試驗(yàn)的測(cè)定。在再現(xiàn)性試驗(yàn)條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過再現(xiàn)性限(R)。被測(cè)物的含量范圍、重復(fù)性和再現(xiàn)性方程見表9-14。

表9-14 含量范圍及重復(fù)性和再現(xiàn)性方程

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