鎮(zhèn)靜劑類藥殘留測定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(6)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assays， ELISA)

免疫分析技術(shù)作為篩選方法具有前處理相對(duì)簡單，分析速度較快的特點(diǎn)，受到廣泛的關(guān)注，而ELISA技術(shù)是殘留分析中最為常用的免疫分析方法。

王自良選擇苯巴比安苯環(huán)對(duì)位作為偶聯(lián)位點(diǎn)，引入活性氨基作為間隔臂，經(jīng)硝化和還原兩步化學(xué)反應(yīng)合成半抗原-對(duì)氨基苯巴比妥，并用重氮化法偶聯(lián)于蛋白，合成免疫原，免疫新西蘭白兔獲得多克隆抗體。測試ELISA效價(jià)為1：6.4×105，阻斷ELISA測定的IC50為14.8μg/L，與巴比妥交叉反應(yīng)率為5.2%。建立ELISA方法的靈敏度為0.88 μg/L， LOD為1.0 μg/L，檢測豬尿樣添加回收率為95.53%，平均批內(nèi)和批間CV均小于15%；與其他化合物無交叉反應(yīng)，不同生物基質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果影響不大。

李秋生用混合酸酐法與活化的牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，合成了免疫原和包被抗原。用免疫原免疫小鼠，制備了硝西泮的單克隆抗體，與結(jié)構(gòu)類似物氯硝西泮、地西泮及其代謝物7-氨基硝西泮、7-氨基氯硝西泮都具有較高交叉反應(yīng)，而與其他鎮(zhèn)靜劑交叉反應(yīng)率很低。以此建立的間接ELISA方法，檢測尿液的回收率在62.8%～85.6%之間。王亞賓用地西泮與羥甲基羥胺偶聯(lián)作半抗原，采用混合酸酐法制得免疫原，并通過免疫獲得抗體。建立間接ELISA的IC50為0.145 ng/mL，在動(dòng)物源食品中的LOD為0.1 ng/mL，與其他結(jié)構(gòu)或功能相似的藥物交叉率很小，檢測食品中安定藥物的回收率為68%～92%，CV小于20%。

劉偉等采用混合酸酐法制備出氯丙嗪抗原，免疫小鼠，獲取的氯丙嗪單克隆抗體，建立間接競爭ELISA的IC50 為0.73 ng/mL。并以此建立了雞肝和豬肝中氯丙嗪的ELISA測定方法。方法回收率分別為88%～95%和86%～95%。劉建靜188合成了氯丙嗪人工免疫原，免疫后獲得兔抗氯丙嗪抗血清。以此建立ELISA方法檢測牛奶中氯丙嗪殘留，LOD為4.5 ng/mL，添加回收率在65%～114.6%之間。孫文佳等還將ELISA 法與化學(xué)發(fā)光法結(jié)合，建立了氯丙嗪的間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測方法，其IC50為0.12 μg/L， LOD為0.02 μg/L。

Cooper等制備了阿扎哌醇、丙酰丙嗪和卡拉洛爾的多克隆抗體。阿扎哌醇抗體與阿扎哌隆交叉反應(yīng)率28%，丙酰丙嗪抗體與氯丙嗪、乙酰丙嗪交叉反應(yīng)率為24.9%和11.7%。用三種抗體建立了同時(shí)測定動(dòng)物腎臟中阿扎哌醇、阿扎哌隆、丙酰丙嗪、氯丙嗪、乙酰丙嗪和卡拉洛爾等6種藥物的ELISA檢測方法，LOD 分別為5μg/kg、15μg/kg、5μg/kg、 20 μg/kg、5 ug/kg、5 ug/kg。

(7)傳感器技術(shù)(sensor)

傳感器技術(shù)發(fā)展迅速，在鎮(zhèn)靜劑分析中，按照識(shí)別機(jī)制主要有分子印跡傳感器和免疫傳感器。

1)分子印跡傳感器

分子印跡傳感器將分子印跡的選擇性與傳感器的靈敏度結(jié)合起來，可以制成高選擇性、高靈敏度和長壽命的檢測工具。一般將MIP作為識(shí)別元件固定在傳感器界面，分析物與MIP的鍵合作用經(jīng)傳感器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)并放大，而得以檢測。劉曉芳等9在一次性絲網(wǎng)印刷電極上原位制備地西泮的分子印跡膜，與便攜式電導(dǎo)儀相連接，組裝成檢測地西泮的電導(dǎo)型傳感器，并測試了肉樣品中地西泮的含量。該傳感器對(duì)地西泮具有很高的靈敏度和特異性，LOD為0.008mg/L，線性范圍為0.039～1.25 mg/L，基于肉品的檢測回收率為91.3%～95.0%，可用于現(xiàn)場快速檢測。

2)免疫傳感器

免疫傳感器是將免疫測定法與傳感器技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型生物傳感器。將抗原或抗體固定在傳感器基體.上，通過傳感技術(shù)使抗原抗體反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的物理、化學(xué)、電學(xué)或光學(xué)上的變化，轉(zhuǎn)變成可檢測的信號(hào)來測定待測分子的濃度。Salmain 等研制出免疫傳感器用于苯巴比妥殘留檢測，并與HPLC、ELISA 進(jìn)行了對(duì)比。方法回收率為100%～110%，CV 為6%～10%，與HPLC結(jié)果相關(guān)性為0.95。與ELISA方法比較，樣品預(yù)處理更簡單，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。

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