吡唑酮類藥殘留測(cè)定——液相色譜-質(zhì)譜法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(7)液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

HPLC法不能提供結(jié)構(gòu)方面的信息，無(wú)法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行確證，也無(wú)法分析復(fù)雜基質(zhì)中痕量殘留化合物。LC-MS特別是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，集液相色譜高效分離與質(zhì)譜的高鑒定能力于一體，在藥物殘留分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，推動(dòng)了復(fù)雜基質(zhì)(如動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟)中多殘留分析的發(fā)展。

由于吡唑酮類藥物理化性質(zhì)的不同(安乃近及其代謝物為堿性藥物，而保泰松、羥布宗為酸性藥物)，一般采取不同電離模式進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。

1)堿性藥物

安乃近及其代謝物顯堿性，質(zhì)譜檢測(cè)電離一般選正離子模式。安乃近的二級(jí)代謝物FAA、AA和AAA性質(zhì)較為穩(wěn)定，采用外標(biāo)法定量可以得到滿意的結(jié)果；而其一級(jí)代謝物MAA穩(wěn)定性相對(duì)較差，通常采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

沈金燦等建立了牛和豬肌肉中安乃近代謝物殘留的LC-MS/MS分析方法。采用Atlantis C18色譜柱(150mm×2.1mm，3.5μm)分離，流動(dòng)相為5 mmol/L乙酸銨溶液(pH 4.5)和乙腈，梯度洗脫，流速0.3mL/min；噴霧電壓5.0kV，去簇電壓40V，聚焦電壓200V，碰撞室射入電壓10V，碰撞室射出電壓15V，去溶劑溫度450℃，電噴霧(ESI)正離子、MRM模式檢測(cè)。FAA和AAA采用外標(biāo)法定量，AA和MAA以4-異丙氨基安替比林(4-iso propylaminoantipyrine，IAA)作為內(nèi)標(biāo)定量。FAA和AA的LOD為1.0μg/L，AAA和MAA為0.5 μg/L；在添加濃度5～200ng/g范圍內(nèi)，F(xiàn)AA的回收率為81.6%～94.0%，AAA為81.2%～90.2%，AA為82%～101%，MAA為78.5%～87.0%；RSD均在7%以內(nèi)。研究表明，采用正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，通常需要在溶液中維持一定的酸度使分析物容易質(zhì)子化而帶正電荷；然而pH太低，各組分的保留降低，容易與基質(zhì)組分共洗脫而使其響應(yīng)受到抑制。在pH4.5條件下，以5mmol/L醋酸銨緩沖體系作為流動(dòng)相，各組分得到比較好的分離，并且質(zhì)譜上有較強(qiáng)響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，即使在中性和室溫條件下，低濃度的安乃近在緩沖溶液中也容易迅速轉(zhuǎn)化成MAA。張?bào)P等建立了豬肉中氨基比林、安替比林、安乃近代謝物FAA、AA、AAA和MAA殘留檢測(cè)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)。色譜柱為Waters BEH C18(2.1mm×5mm，1.7um)，流動(dòng)相為含0.1%甲酸的乙腈和0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，柱溫30℃，流速0.3 mL/mL；質(zhì)譜條件為ESI+、MRM方式。在5～500ng/mL范圍，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性；平均回收率為71.5%～100%；批內(nèi)、批間CV均小于10%；LOD為2μg/kg，LOQ為5μg/kg。Jedziniaka等建立了牛肉中安乃近代謝物FAA、AA、AAA和MAA殘留的LC-MSMS測(cè)定方法。樣品用C8色譜柱(150mm×2.1mm，3.5um)分離，流動(dòng)相為甲醇-乙腈(8+2，v/v)和0.01mol/L甲酸銨溶液(pH5.0)，流速0.3mL/min，梯度洗脫，離子源溫度600℃，毛細(xì)管電壓5.5kV，ESI+、MRM模式檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV為7%～30%；回收率為45%～95%；MAA、FAA、AAA和AA的CCa分別為113μg/kg、11.6μg/kg、11.6ug/kg和12.6μg/kg，CCβ分別為139μg/kg、16.5μg/kg、15.8μg/kg和16.4μg/kg。張崇等建立了羊肌肉組織中安乃近4種主要代謝物(MAA、AA、FAA和AAA)的親水LC-MS/MS分析方法。肌肉樣品均質(zhì)后，用體積分?jǐn)?shù)為5%的氨水乙腈提取，提取液用Cleanert PSA初步凈化，60℃氮?dú)獯蹈?，乙腈?fù)溶后過(guò)MAX柱凈化，采用親水LC-MS/MS測(cè)定，4種物質(zhì)均采用外標(biāo)法定量。在5 μg/kg、50 μg/kg、100μg/kg、1000ug/kg 4個(gè)添加濃度，方法回收率在75.02%～116.2%之間，日內(nèi)CV為1.63%～15.12%，日間CV均小于11%；MAA、FAA和AAA的LOD均為0.5μg/kg，AA為5μg/kg。

沈金燦等還建立了牛奶和奶粉中FAA、AAA、MAA和AA的LC-MS/MS檢測(cè)方法。采用BEH C18色譜柱分離，流動(dòng)相為5mmol/L乙酸銨溶液(pH4.5)和甲醇，梯度洗脫，流速0.25mL/min，柱溫40℃；ESI+、MRM模式檢測(cè)，噴霧電壓3kV，碰撞氣為氬氣，輔助氣為氮?dú)?，輔助氣流速750L/h，輔助氣溫度350℃，離子源溫度105℃。FAA、AAA和AA采用外標(biāo)法定量，MAA采用IAA為內(nèi)標(biāo)定量。FAA、AA、AAA、MAA的LOD分別為0.24μg/kg、0.59μg/kg、0.20μg/kg和0.61μg/kg；在添加量5～20μg/kg范圍內(nèi)，4種安乃近代謝物的回收率在80.4%～97.9%之間，RSD均小于9%。

Penney等建立了牛奶、牛肉、豬肉中安乃近及其代謝物殘留的測(cè)定方法。色譜柱采用Inertsil ODS-3柱，流動(dòng)相為0.05mmol/L甲酸銨-乙腈，梯度洗脫，流速0.3mL/min，LC-ESI+-MS/MS，MRM模式檢測(cè)。FAA、AA和MAA的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.02～0.20ug/g，安乃近為0.2～2.0ug/g；牛奶和豬肉中各藥物回收率在82%～128%之間，CV均小于11%；FAA、AA和MAA的LOD小于0.02μg/g，安乃近的LOD小于0.13μg/g。

2)酸性藥物

保泰松和羥布宗呈酸性，LC-MS檢測(cè)用負(fù)離子模式電離。

Clark等分別采用液相色譜-單極四極桿質(zhì)譜(LC-MS)和液相色譜-離子阱質(zhì)譜(LC-MSn)檢測(cè)牛腎中保泰松殘留。色譜柱為YMC ODS-AQ柱(2mm×100mm，3μm)，流動(dòng)相為乙腈和乙酸銨緩沖液，梯度洗脫。LC-MS測(cè)定質(zhì)譜離子源為ESI、SIM模式檢測(cè)，脫溶劑氣為氮?dú)?，流?0L/min，溫度200℃，源內(nèi)電壓-165V，霧化氣為氮?dú)猓瑲鈮?0psi。在25μg/kg添加濃度，5個(gè)樣品中有2個(gè)滿足檢測(cè)確證陽(yáng)性條件，另外3個(gè)檢測(cè)信噪比(S/N)小于3。而LC-MSn則采用ESI、MRM模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓-3.88kV，毛細(xì)管溫度350℃，檢測(cè)靈敏度大于LC-MS，在5～10ppb添加濃度，均可全部檢出。

Dubreil-Cheneau等用甲醇提取牛奶中羥布宗、保泰松等12種藥物后，直接進(jìn)LC-MS/MS分析。以C18色譜柱(150mm×2mm，5μm)分離，流動(dòng)相為1mmol/L乙酸+乙腈(90+10，v/v)和乙腈，梯度洗脫，流速0.4mL/min，三重四極桿質(zhì)譜以ESI、MRM模式檢測(cè)。質(zhì)譜條件：樣品管和脫溶劑溫度為350℃，毛細(xì)管電壓4000V，鞘氣壓力為35任意單位，輔助氣壓力為10任意單位，離子吹掃氣壓為25任意單位，碰撞氣壓1mTorr，駐留時(shí)間50ms。方法CCβ為0.5μg/kg，回收率為94.7%～110.0%，CV為2.9%～14.7%。Gentili等采用LC-MS/MS測(cè)定牛奶和牛肉中保泰松等15種藥物。用XTerra-MS C18(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱分離，流動(dòng)相為乙腈-甲醇(1+1，v/v，含0.2mmol/L二丁胺)和水，梯度洗脫，流速1mL/min，分流比1：9，10%進(jìn)入三重四極桿質(zhì)譜分析。離子源為渦輪離子噴霧(Turbo lon Spray)，干燥氣和源溫度為200℃，負(fù)離子源模式，毛細(xì)管電壓-4500V，MRM模式監(jiān)測(cè)。牛奶中保泰松的CCa和CCβ分別為0.71μg/kg和1.23μg/kg，牛肉中為0.92μg/kg和1.84μg/kg；回收率接近100%。

3)酸性和堿性藥物同時(shí)檢測(cè)

本類藥物的酸堿性不同，但采用分開進(jìn)樣或電離源正負(fù)離子切換方式，可同時(shí)測(cè)定保泰松、羥布宗、安乃近代謝物等吡唑酮類藥物。

Jedziniak等建立了牛奶中保泰松、羥布宗和安乃近4個(gè)代謝物等藥物的LC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈-乙酸銨緩沖溶液提取，提取液分成兩份，一份用于直接測(cè)定堿性藥物安乃近及其代謝物，另一份經(jīng)氨基SPE柱凈化后，測(cè)定酸性藥物保泰松和羥布宗。采用Phenomenex Luna C8色譜柱分離，流動(dòng)相為甲醇-乙腈(8+2，v/v)和0.01 mol/L甲酸銨(pH5.0)，梯度洗脫，流速0.2mL/min，ESI電離，離子源溫度600℃，毛細(xì)管電壓為-5.5kV(負(fù)離子模式)和+5.5kV(正離子模式)，MRM模式檢測(cè)。保泰松和羥布宗為負(fù)離子，安乃近代謝物FAA、AA、AAA和MAA為正離子模式。CV為7%～28%，回收率為71%～116%；MAA的CCa和CCβ分別為55ug/kg和61μg/kg，AAA、AA和FAA的CCa和CCβ均在5.2～6.8μg/kg之間，保泰松和羥布宗的CCa和CCβ均在2.7～3.2μg/kg之間，滿足殘留測(cè)定要求。

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