吡唑酮類藥殘留分析技術(shù)前處理——提取方法（一）

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(2)提取方法

吡唑酮類藥物在中性條件下最穩(wěn)定，在酸、堿性條件下穩(wěn)定性降低，應(yīng)盡快處理，減少藥物水解。該類藥物的吡唑酮環(huán)，上的不飽和鍵易被氧化，提取溶劑中常加入二硫蘇糖醇、維生素C等還原性穩(wěn)定劑；同時(shí)，在操作中應(yīng)盡量避免高溫和光照，避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶液。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

生物基質(zhì)(血液、尿液、乳汁和組織)中吡唑酮類藥物主要采用液液萃取(LLE)的方法進(jìn)行提取。已報(bào)道的保泰松和/或羥布宗提取溶劑主要包括乙腈、乙酸乙酯、乙醚-正已烷、乙腈、酸性溶劑等；安替比林提取溶液有氯仿、硫酸鈉-亞硫酸鈉溶液等。吡唑酮類藥物中氨基比林、安替比林和安乃近代謝物顯堿性，而保泰松、羥布宗呈酸性，提取方法往往根據(jù)藥物酸堿性進(jìn)行，有所不同。

A.堿性藥物

本類藥物在酸堿性條件下易水解，應(yīng)盡量在中性條件提取和凈化；若選擇酸堿性條件時(shí)，應(yīng)盡快完成操作。

a.中性提取

沈金燦等測(cè)定牛和豬肌肉組織中殘留安乃近的3種代謝物FAA、AA和MAA殘留。為保持藥物穩(wěn)定性，選擇pH 7.0的0.1 mol/L的Na2SO4提取，同時(shí)在提取溶液中加入抗氧化劑20 mmol/L的Na2SO3，防止氧化。HPLC測(cè)定FAA的LOD為12.5μg/L，AA為15.0 μg/L， MAA為20.0 μg/L；3種代謝物的LOQ均為50 ug/L；在添加水平50～400 μg/kg范圍內(nèi)，F(xiàn)AA的回收率為81.3%～92.5%，AA為82.0%～96.0%，MAA為80.4%～90.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在7%以內(nèi)。該方法用水性溶劑提取，提取液中雜質(zhì)較多，對(duì)后續(xù)凈化要求較高。

而采用有機(jī)溶劑/混合溶劑直接提取的報(bào)道較多。Penney等測(cè)定牛肉、豬肉中安乃近及其代謝物殘留，用甲醇提取，液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)測(cè)定。方法平均回收率為82%～128%，F(xiàn)AA、AA和MAA的LOD均小于0.02μg/g，安乃近LOD小于0.13μg/g。Inaba等測(cè)定尿液中安替比林及其代謝物，尿液酶解后用PBS緩沖液調(diào)節(jié)pH 7.4，用同等體積的乙酸乙酯提取4次，提取液蒸干后用氯仿復(fù)溶。Mikati等測(cè)定尿液中安替比林及其代謝物，尿液酶解后，用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后用流動(dòng)相復(fù)溶。張?bào)P等測(cè)定豬肉中氨基比林、安替比林和安乃近代謝物殘留，樣品直接用乙腈提取，提取液高速離心后，取上清液直接液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)分析。豬肉中的LOD為2μg/g，LOQ為5μg/g；平均回收率為71.9%～100%；批內(nèi)批間CV均小于10%。

b.堿性提取

在堿性條件下，氨基比林、安乃近、安替比林及其代謝物更易被有機(jī)溶劑提取。

沈金燦等測(cè)定牛奶和奶粉中安乃近的4個(gè)代謝物：FAA、AAA、MAA和AA殘留。樣品加入Tris溶液調(diào)節(jié)至堿性，再加入乙腈提取，提取液凈化后用LC-MS/MS測(cè)定，AAA、FAA和AA采用外標(biāo)法定量，MAA采用內(nèi)標(biāo)法定量。FAA的LOD為0.24μg/kg，AA為0.59μg/kg，AAA為0.20μg/kg，MAA為0.61μg/kg；在添加量5～20μg/kg范圍內(nèi)，4種代謝物的回收率在80.4%～97.9%之間，RSD均小于9%。牛奶中含有鈣、鎂等金屬離子，容易與目標(biāo)化合物形成絡(luò)合物，影響樣品的測(cè)定，在樣品提取中加入保護(hù)劑以避免金屬元素對(duì)這些化合物的干擾。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在加入乙腈提取液前，預(yù)先在牛奶樣品中加入1.0mol/L的堿性Tris緩沖液，使其與樣品中的金屬形成氫氧化物沉淀，而安乃近各代謝物溶解在溶液中，這樣降低了金屬或其他物質(zhì)的干擾。同時(shí)，牛奶樣品中含有大量的蛋白質(zhì)，能夠與藥物結(jié)合，在提取過(guò)程中形成泡沫、渾濁或出現(xiàn)沉淀而干擾測(cè)定，而乙腈也可以同時(shí)去除蛋白和脂肪。Katz等測(cè)定血漿中安乃近的4種代謝物，樣品用氫氧化鈉溶液堿化后用二氯甲烷提取，提取液蒸干復(fù)溶后用HPLC測(cè)定，以異丙基氨基安替比林為內(nèi)標(biāo)定量。FAA和AAA的校正回收率為96.0%～100%，MAA和AA為70.6%～87.8%，CV均低于6.7%，LOD為0.1μg/mL。

Shively等測(cè)定唾液中安替比林和氨基比林。1mL唾液樣品中加入1mL 1mol/L氫氧化鈉溶液堿化，再加入氯仿提取，離心后取氯仿層，蒸干后復(fù)溶于二氧六環(huán)，GC測(cè)定。安替比林和氨基比林的線性范圍均為0～10μg/mL，CV為1.7%和2.4%，回收率為87%和95%。實(shí)驗(yàn)表明，堿化液體樣品有助于安替比林和氨基比林轉(zhuǎn)移至有機(jī)溶劑

Abernethy等提取血漿中安替比林，1 mL血漿中加入1mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，再加入6 mL乙酸乙酯提取，離心，取乙酸乙酯層蒸干復(fù)溶后GC測(cè)定。方法LOD為1 μg/mL，回收率大于95%，CV小于6.6%。

c.酸性提取

也有在酸性條件下用有機(jī)溶劑萃取的報(bào)道。酸性條件萃取的優(yōu)點(diǎn)是共萃取的組織基質(zhì)較少，但應(yīng)加大提取溶劑使用量，并使用極性稍強(qiáng)的有機(jī)溶劑，以提高萃取效率。

崔景斌等測(cè)定血漿中安乃近代謝物，取血漿0.5mL，加入內(nèi)標(biāo)物異丙氨基安替比林，用0.1mL 0.1mol/L的HCI酸化，加無(wú)水乙醚萃取，離心取醚層吹干，殘留物用流動(dòng)相溶解，HPLC測(cè)定。MAA的絕對(duì)回收率為82.5%，相對(duì)回收率為99%，CV小于3.66%。Jedziniak等測(cè)定牛肉中安乃近的4種代謝物FAA、AAA、AA和MAA殘留。樣品經(jīng)乙腈-0.33mol/L乙酸鈉(8+2，v/v)緩沖溶液提取，LC-MS測(cè)定。CV為7%～30%，回收率為45%～95%；FAA、AAA、AA和MAA的檢測(cè)限(CCa)分別為11.6μg/kg、11.6μg/kg、12.6μg/kg和113μg/kg，檢測(cè)能力(CCβ)分別為16.5μg/kg、15.8μg/kg、16.4μg/kg和139μg/kg。

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