四環(huán)素類藥物殘留分析技術(shù)——前處理方法(二)
四環(huán)素類藥物殘留分析技術(shù)——前處理方法(二)
[db:作者] / 2022-12-19 00:00(2)凈化方法
目前國內(nèi)外有關(guān)生物樣品中TCs殘留的樣品凈化方法主要有固相萃取(SPE)、磁性固相萃取(MSPE)、固相微萃取(SPME)、基質(zhì)固相分散(MSPD)、分子印跡技術(shù)(MIT)、限進(jìn)介質(zhì)(RAM)、金屬螯合親和層析(MCAC)等技術(shù)。
1)固相萃取(solidphaseextraction,SPE)
SPE不需要大量有機(jī)溶劑,不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,可凈化很小體積的樣品,被廣泛用于分離和凈化樣品中的TCs。SPE柱通常選擇基于反相保留機(jī)理的HLB、C18、Strata-X凈化,也有采用基于陰離子交換機(jī)理的SAX、MAX等,此外還可聯(lián)合用柱,以提高凈化效果。
Peres等采用C18 SPE柱凈化蜂蜜中的OTC、TC和CTC。3g蜂蜜中加入15mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4.0)提取,C18 SPE柱分別用5mL甲醇和5mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液平衡,5mL樣品上樣通過SPE柱,2.5mL mellvaine緩沖液-甲醇(85+15,v/v)和2.5mL水洗滌,減壓干燥2min,2.5mL乙腈再次洗滌,減壓干燥1min,3.0mL乙酸乙酯-甲醇(75+25,v/v)洗脫,30~35℃水浴中氮?dú)獯蹈桑?mL甲醇-水(15+85,v/v)復(fù)溶,過濾后HPLC檢測(cè)。方法的回收率為86%~111%,CV低于11%,LOD和LOQ分別為8μg/kg和25μg/kg。由于TCs容易與金屬離子整合,一般采用EDTA對(duì)SPE柱進(jìn)行預(yù)處理,可以有效避免TCs在SPE柱的損失,提高回收率。Suarez等采用多壁碳納米管(MWNTs)吸附凈化水樣中的TCs,并與毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)串聯(lián)分析,方法LOD在0.30~0.69μg/L之間,回收率為98.6%~103.2%。Aoyama等報(bào)道,未經(jīng)EDTA處理的C18柱由于硅膠基表明的硅烷醇基的存在及殘余的金屬離子易與TCs結(jié)合,而影響凈化效果和回收率,將EDTA加入上樣液中或預(yù)處理SPE柱,則可以獲得較好效果。以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS/DVB)為填料的反相柱與烷基鍵合硅膠柱相比,PS/DVB填料本身具有疏水性和可再生性,不需要鍵合烷基鏈,因此不存在TCs與殘余硅羥基結(jié)合產(chǎn)生的峰形拖尾現(xiàn)象。Blasco等采用HLB固相萃取柱凈化牛、豬、家禽和羔羊肌肉組織中的CTC、TC、OTC和DC。方法以水為提取溶液,ASE提取,提取液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化,5mL甲醇和5mL水活化,提取液過柱后,2mL甲醇-水(95+5,v/v)洗滌,2mL甲醇洗脫(10mmol/L甲酸酸化),洗脫液吹干,1mL甲醇-水(50+50,v/v)復(fù)溶,LC-MS/MS檢測(cè)。方法平均回收率高于89%,日內(nèi)和日間CV分別低于15%和17%,LOQ為0.5~1.0μg/kg,CCa和CCβ分別為101~116μg/kg和112~130μg/kg。Koesukwiwat等采用HLB柱凈化牛奶中的3種TCs,回收率在72.01%~97.39%之間,RSD小于11.08%。Andersen等也采用HLB柱凈化蝦和牛奶中的TC、OTC和CTC,回收率超過75%,RSD小于10%。Xu等則采用HLB柱凈化蜂王漿中的TC、OTC、CTC和DC,方法回收率在62%~115%之間,CV為3.4%~16.3%。Wang等采用Strata-XSPE柱凈化蜂蜜中的OTC、TC、CTC和DC。5g蜂蜜用15mL 0.1mol/L乙酸鈉溶液(pH4.5)稀釋,攪拌器1000r/min攪拌5min,過濾后過SPE柱(10mL甲醇、10mL水和10mL 0.1mol/L乙酸鈉溶液平衡),SPE柱真空干燥5min,5mL乙酸乙酯洗脫,洗脫液40℃旋轉(zhuǎn)蒸干,0.25mL甲醇-0.01mol/L鹽酸溶液(20+80,v/v)復(fù)溶,HPLC檢測(cè)。方法的回收率為95.3%~103.5%,CV低于2.79%,LOD為2.12~5.12μg/mL。
龐國芳等比較了單一固相萃取柱凈化(OasisHLB)和雙柱凈化(HLB和Carboxylic acid陰離子交換柱)禽肉中OTC、TC、CTC、DC的效果。禽肉樣品用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4)提取,提取液以不超過3mL/min的流速通過HLB固相萃取柱,5mL甲醇-水(5+95,v/v)洗滌,減壓抽干20min,15mL乙酸乙酯洗脫,洗脫液在減壓下以不超過3mL/min的流速通過Car-boxylicacid陰離子交換柱,5mL甲醇洗柱,減壓抽干5min,4mL乙腈-甲醇-0.01mol/L草酸溶液(2+1+7,v/v)洗脫于5mL樣品管中,定容至4mL,紫外檢測(cè)器于350nm測(cè)定。在5~100μg/kg添加水平,方法回收率為60%~100%,RSD在16%以內(nèi);OTC、TC的LOD為2μg/kg,CTC、DC的LOD為5μg/kg。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),單獨(dú)使用HLB柱凈化,在4.3min、4.9min、5.5min和8.2min均有比較大的干擾峰存在,當(dāng)OTC、TC、CTC、DC含量小于0.010mg/kg,對(duì)檢測(cè)結(jié)果均有影響,而采用HLB和Carboxylicacid陰離子交換柱雙柱凈化,從4min到18min之間均無干擾峰,改進(jìn)了凈化效果,減少了基質(zhì)干擾,提高了方法的準(zhǔn)確度。Jia等B3采用HLB和MAX柱聯(lián)合凈化水樣中的6種TCs及其10種代謝物。經(jīng)MAX凈化后,LC-MS/MS色譜峰出峰范圍內(nèi)的干擾峰消失,方法回收率為34%~113%,LOD為0.8~17.5ng/L。
2)磁性固相萃取(magnetic solid phase extraction,MSPE)
MSPE是一種以磁性或可磁化的材料作吸附劑基質(zhì)的一種固相萃取技術(shù)。在MSPE過程中,磁性吸附劑不直接填充到吸附柱中,而是被添加到樣品的溶液或懸浮液中,將目標(biāo)分析物吸附到分散的磁性吸附劑表面,在外部磁場(chǎng)作用下就可使目標(biāo)分析物與樣品基質(zhì)分離開來。與普通的SPE技術(shù)相比,MSPE萃取過程簡(jiǎn)單化,不需要昂貴的設(shè)備,化學(xué)物質(zhì)的使用量大為減少,且沒有二次污染產(chǎn)生。MSPE不僅能萃取溶液中的目標(biāo)分析物,還能萃取懸浮液中的目標(biāo)分析物,且由于樣品中的雜質(zhì)一般都是反磁性物質(zhì),能有效地避免雜質(zhì)的干擾。因此,MSPE被人們?cè)絹碓蕉嗟膽?yīng)用于環(huán)境、食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域中樣品的分離和富集。
Rodriguez等采用MSPE方法凈化牛奶中的CTC、TC、OTC,牛奶樣品直接經(jīng)MSPE凈化,酸化甲醇洗脫。在50mL牛奶中加入0.3g硅烷化磁性SPE填料,攪拌20min使均勻分散,靜置5min,用磁鐵分離硅烷化磁性填料,10mL的EDTA(1mmol/L)洗滌,3×1.5mL乙酸甲醇溶液(1mmol/L)洗脫,取0.5mL洗脫液,加入0.5mL的EDTA溶液(1mmol/L),硼酸鹽緩沖劑稀釋至10mL,紫外-可見分光光度計(jì)540nm檢測(cè)。方法的線性范圍為0.03~0.60mg/L,LOD為10μg/L,平均回收率為91.0%~97.0%,CV低于5%。
3)固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)
SPME的選擇性是根據(jù)“相似相溶”原理,結(jié)合被測(cè)物的極性、沸點(diǎn)和分配系數(shù),通過選用具有不同涂層材料的纖維萃取頭而實(shí)現(xiàn)的。SPME-HPLC技術(shù)已經(jīng)在涂層材料和操作方式兩方面獲得了較大的發(fā)展,在操作方式上,除最初的手動(dòng)SPME-HPLC繼續(xù)獲得發(fā)展外,管內(nèi)SPME-HPLC(in-tube-SPME-HPLC)等新開發(fā)的操作方式也取得很快發(fā)展。
Wen等以生物相容性的聚合整體毛細(xì)管柱作為吸附媒介,利用在線管內(nèi)SPME-HPLC對(duì)魚肉中CTC、TC、OTC和DC進(jìn)行分析檢測(cè)。取1.0g鯽魚肌肉樣品,加入10mL 0.01mol/L的EDTA-Macllvaine緩沖液(pH4.0),手動(dòng)混合10min,4℃避光靜置30min,12000r/min離心5min,上清液SPME凈化,HPLC檢測(cè)。在100~10000ng/g濃度范圍內(nèi)抗生素的線性關(guān)系良好,LOD為16~30ng/g,回收率為68.1%~75.9%,日內(nèi)和日間CV分別低于4.22%和5.71%。整體毛細(xì)管由于增大了與樣品溶液的接觸面積,使目標(biāo)物的提取效率更高,樣品前處理簡(jiǎn)便快捷,無需處理魚肉中的蛋白和脂肪。Hu等以TC為模板,合成了分子印跡聚合物(MIPs),涂層SPME纖維,用以凈化雞肉和牛奶中的痕量TC、OTC、DC和CTC,并采用在線HPLC方法檢測(cè)。方法回收率均超過71.6%,LOD在1.0~2.3μg/L之間。Tsai等報(bào)道了采用分散固相微萃取(dispersive-SPME)凈化奶中TC、OTC、CTC和DC的方法。作者發(fā)現(xiàn),基于硅膠的吸附劑,尤其是用伯胺、仲胺或羰基官能化的,在有機(jī)環(huán)境下,其吸附容量比聚合物吸附劑更高。用乙腈萃取,并加鹽促進(jìn)分配后,TCs用少量的伯胺和仲胺硅膠吸附劑吸附,解吸后用HPLC檢測(cè)。方法回收率為97.1%~104.1%,LOD在7.9~35.3ng/g之間。
4)金屬螯合親和層析(metal chelate affinity chromatographic,MCAC)
MCAC是將吸附材料經(jīng)CuSO4溶液處理,含有TCs的提取液經(jīng)MCAC凈化,TCs與結(jié)合在瓊脂凝膠柱上的Cu整合而被專一性地吸附在柱填料上,再以EDTA-Mcllvaine緩沖液洗脫,達(dá)到與其他雜質(zhì)分離的目的。
Stubbings等利用在線MCAC-HPLC檢測(cè)動(dòng)物組織中的TCs殘留。25uL CuSO4溶液(50g/L)和500μL純水活化MCAC柱,提取液以0.36mL/min流速上樣,500uL純水、500μL甲醇、500μL純水分別洗滌,KH2PO4-EDTA-Mcllvaine緩沖液洗脫,KH2PO4-EDTA-Mcllvaine緩沖液-甲醇-乙腈和KH2PO-EDTA-Mllvaine緩沖液分別平衡以再生MCAC柱。方法檢測(cè)OTC和TC的LOD為10μg/kg,檢測(cè)CTC和DMCT的LOD為20μg/kg,回收率為50%~80%。Cooper等報(bào)道了采用在線MCAC-HPLC測(cè)定動(dòng)物組織和雞蛋中TCs的方法。用乙酸乙酯提取,蒸干后用甲醇復(fù)溶,在線MCAC-HPLC檢測(cè)。當(dāng)添加濃度為25ug/kg時(shí),TC、OTC、CTC和DMCT的回收率在42%~101%之間,LOD優(yōu)于10ug/kg。Croubels等用琥珀酸鈉緩沖液和甲醇均質(zhì)提取動(dòng)物組織和雞蛋樣品中的TCs,離心后,MCAC凈化,再經(jīng)陽離子交換萃取膜富集后,HPLC檢測(cè)。TCs的回收率為40%~70%,RSD小于10%;LOD在0.42~1.38ng/g之間,LOQ在2~5ng/g之間。
5)基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid phase dispersion,MSPD)
MSPD是將樣品與C18、氧化鋁等吸附劑一起混合研磨,使樣品均勻分散于固定相顆粒表面,制成半固態(tài)后裝柱,然后選擇合適的洗脫劑洗脫。MSPD技術(shù)濃縮了傳統(tǒng)樣品前處理中勻漿、提取、凈化等過程,避免了待測(cè)物在這些過程中的損失,具有提取凈化效率高、節(jié)省溶劑、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。
張素霞等建立了牛奶中CTC、TC、OTC和DC殘留的MSPD提取和凈化方法。稱取22g C18填料,裝入50mL玻璃注射器,分別用兩倍柱體積的正己烷、二氯甲烷和甲醇依次洗滌,真空干燥;稱取2g干燥后的C18填料置于玻璃研缽中,分別加入0.05g Na2EDTA和草酸,將0.5mL牛奶樣品加至C18填料上,用玻璃杵輕輕研磨30s,使樣品與填料均勻混合,取5mL玻璃注射器,下端墊一片濾紙,加無水硫酸鈉至0.2mL體積,將樣品裝入,上墊一片濾紙,壓至體積為4.2mL;用8mL正已烷洗滌,真空抽干后用乙酸乙酯-乙腈(1+3,v/v)洗脫于雞心瓶中,加0.1mL乙二醇,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑,殘留物用0.4mL甲醇-乙腈-0.01mol/L草酸(2+3+5,v/v)溶解,渦動(dòng)混合15s,轉(zhuǎn)至玻璃離心管中,2000g離心10min;取上清液進(jìn)樣,HPLC測(cè)定。方法的平均回收率為78.7%~90.2%,CV在2.4%~1.18%之間,LOD為0.02~0.05μg/mL。Mu等分別采用硅酸鎂(Florisil)、硅膠和C18作為MSPD吸附劑,建立了牛奶中TC、OTC和DC的殘留方法。將吸附劑與牛奶樣品按4:1混合后裝入注射器,用6mL正己烷洗滌脫脂,6mL 0.1mol/L檸檬酸水溶液-甲醇(1+9,v/v)洗脫,洗脫液氮?dú)獯蹈桑?.5mL甲醇復(fù)溶,0.45um濾膜過濾,CE分析。結(jié)果顯示,采用C18的回收率最高,平均回收率為93.4%~102%,LOD為0.0745~0.0808μg/mL。
6)分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology,MIT)
MIT是通過化學(xué)手段人工合成的高分子仿生材料。在目標(biāo)分子(模板分子)的存在下交聯(lián)聚合,然后洗脫除去模板分子,在立體空穴和作用位點(diǎn)上與模板分子具有互補(bǔ)的結(jié)構(gòu),又具有模板分子可回收重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn),因此在分子識(shí)別中有著特殊的選擇性。
李倩等用沉淀聚合的方法以DC為模板分子合成對(duì)TC、OTC、CTC具有特異性識(shí)別的MIPs。1mmoL鹽酸強(qiáng)力霉素、60mL乙腈、8mmoL甲基丙烯酸(MAA)、16mmoL三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和45mg偶氮二異丁腈(ABIN)混合,通氮除氧后,60℃磁力攪拌反應(yīng)24h,獲得MIPs。識(shí)別性能和物理特性驗(yàn)證表明,該MIPs對(duì)TCs有特異性吸附作用,并具有良好的穩(wěn)定性。以該MIPs作為填料制備SPE小柱,凈化條件為:5mL甲醇活化,10mL水溶液上樣,3mL 5%甲酸水溶劑淋洗,6mL 1%甲酸-甲醇溶液洗脫。該小柱最大載樣量為0.2mg,平均回收率為72.31%~90.85%,CV低于10%。Sun等以TC作為模版,MAA為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑,甲醇為溶劑,環(huán)己醇和十二烷醇作為混合致孔溶劑,首次采用原位MIT技術(shù)制備了TC印跡整體柱,并對(duì)合成條件和性能進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)估。該整體柱與C18 SPE柱連接,被用于牛奶和蜂蜜中TCs的凈化,方法回收率在73.3%~90.6%(牛奶)和62.6%~82.3%(蜂蜜)之間。Hu等以TC為模板,丙烯酰胺為功能單體通過三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯合成MIPs,涂層SPME纖維,采用在線HPLC檢測(cè)雞肉和牛奶中的痕量TC、OTC、DC、CTC。方法回收率均超過71.6%。實(shí)驗(yàn)與用普通涂層得到的回收率進(jìn)行了比較,結(jié)果MIPs涂層對(duì)TCs的提取效果令人滿意。
7)限進(jìn)介質(zhì)(restricted access materials,RAM)
RAM也稱為限制進(jìn)入固定相,是一種新型在線樣品預(yù)處理填料,同時(shí)兼具分離和富集功能,通過控制填料的孔徑和對(duì)其外表面進(jìn)行親水性修飾,使得親水性外表面與生物樣品中大分子物質(zhì)不發(fā)生不可逆的變性和吸附,進(jìn)而在死體積或近于死體積的情況下被洗脫除去。具有避免被分析物由于前處理所造成的損失,減少傳統(tǒng)生物樣品制備時(shí)的繁瑣步驟,節(jié)省人力和物力且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。Chico等將二醇基鍵合在多孔硅膠孔外表面,Cs烷基鏈鍵合在內(nèi)表面作限進(jìn)介質(zhì)材料,在線RAM-HPLC檢測(cè)牛奶中TCs。以Mg(NO3)2·6H2O作為柱后衍生試劑,測(cè)得牛奶的CV為6%~9.2%;方法提高了分析物的可檢測(cè)性,但所測(cè)OTC、TC的回收率僅為50%和67%。
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