β-受體激動(dòng)劑殘留測(cè)定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

(4)生物傳感器技術(shù)(biosensor)

其原理為待測(cè)物與分子識(shí)別元件特異性結(jié)合后，所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?hào)、光信號(hào)等，從而達(dá)到分析檢測(cè)的目的。利用生物傳感器可檢測(cè)動(dòng)物尿液、血清中β-受體激動(dòng)劑的含量。肖紅玉等利用抗原抗體專(zhuān)一性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化的原理設(shè)計(jì)成了免疫生物傳感器，克倫特羅的檢出限為0.1ug/L，線性范圍為0.1～8.1ug/L，檢測(cè)時(shí)間在20min以內(nèi)。通過(guò)對(duì)100個(gè)已知陽(yáng)性樣品和100個(gè)已知陰性樣品的測(cè)試，準(zhǔn)確率為97%

Chen等研制了以F0F1-ATP酶為動(dòng)力蛋白的生物傳感器，測(cè)定食品中的克倫特羅。標(biāo)記F1300的內(nèi)色素細(xì)胞熒光探針被用作檢測(cè)由F0F1-ATP酶合成的ATP驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子通量的pH指示劑。此外，F(xiàn)0F1 ATP酶的Flβ亞基附著在“抗抗體-生物素-抗生物素蛋白-生物素-第二抗體(特異性針對(duì)克倫特羅)”系統(tǒng)，作為生物傳感器來(lái)檢測(cè)克倫特羅殘留。捕獲機(jī)理是抗原-抗體反應(yīng)，而檢測(cè)基于旋轉(zhuǎn)催化ATP合成過(guò)程中pH變化引起的熒光變化。結(jié)果表明，F(xiàn)0F1-ATP酶的活性受不同負(fù)載的影響，這種新的生物傳感器可用于超痕量(10-12 g/L)克倫特羅的檢測(cè)。該類(lèi)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、攜帶方便、能重復(fù)利用并能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

(5)流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)(flow injection-chemiluminescence，F(xiàn)I-CL)

Fl-CL的原理是基于把一定體積的液體試樣注射到一個(gè)運(yùn)動(dòng)著的、無(wú)空氣間隔的由適當(dāng)液體組成的連續(xù)載流中。被注入的試樣在向前運(yùn)動(dòng)過(guò)程中由于對(duì)流和擴(kuò)散作用而分散成一個(gè)個(gè)具有濃度梯度的試樣帶，試樣帶與載流中某些組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生某種可以被檢測(cè)的物質(zhì)，然后被載帶到檢測(cè)器中連續(xù)記錄其吸光度、電極電位或其他物理參數(shù)。試樣流過(guò)檢測(cè)器的流通池時(shí)，這些參數(shù)連續(xù)地發(fā)生變化。典型的檢測(cè)儀輸出信號(hào)呈峰形，其高度或面積與待測(cè)物濃度有關(guān)。陳麗莉等設(shè)計(jì)了一種快速檢測(cè)豬肉中鹽酸克倫特羅的Fl-CL免疫分析方法。由辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化的魯米和過(guò)氧化氫-尿素加合物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可通過(guò)4-聯(lián)苯硼酸得到增強(qiáng)。在競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)后，上清酶標(biāo)復(fù)合物由FI-CL法進(jìn)行檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，測(cè)定克倫特羅的線性范圍為0.05～9ug/L(r=0.9959)，檢出限為0.02μg/L。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于豬肉中克倫特羅殘留的檢測(cè)。

(6)色譜技術(shù)(chromatography)

色譜作為一種高效分離分析技術(shù)，是目前β-受體激動(dòng)劑殘留分析中應(yīng)用最廣的分析手段，主要包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等。

1)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是近年來(lái)發(fā)展較快的β-受體激動(dòng)劑殘留分析技術(shù)之一。采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度的檢測(cè)器，具有重現(xiàn)性好、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合紫外檢測(cè)器(UVD)、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、熒光檢測(cè)器(FLD)、電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)等，對(duì)β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)限可以達(dá)到ug/kg級(jí)別。

Miyazaki等采用HPLC-UVD檢測(cè)動(dòng)物組織中克倫特羅，采用ODS柱分離，0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH3.5)-乙腈(7+3，v/v)為流動(dòng)相，流速0.9mL/min，在209nm或242nm檢測(cè)，測(cè)定低限為5ng/g，回收率為75.1%～86.4%。Tsai等采用HPLC-DAD檢測(cè)豬血漿和組織中的克倫特羅和沙丁胺醇?xì)埩簟ova-pak C18色譜柱分離，沙丁胺醇流動(dòng)相為乙腈-水(15+85，v/v)，克倫特羅流動(dòng)相為乙腈-水(30+70，v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm(克倫特羅)和196nm(沙丁胺醇)?？藗愄亓_和沙丁胺醇的檢測(cè)低限分別為0.2uL/L和0.1uL/L；血漿中沙丁胺醇的平均回收率為86.7%，克倫特羅為80.0%；肌肉中沙丁胺醇的平均回收率為64.2%，克倫特羅為62.9%。

Hashimoto等采用HPLC-FLD檢測(cè)肉中的沙丁胺醇。在ODS柱(TSKgel-ODS80Ts)上分離，流動(dòng)相為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH3.0)-乙腈(92+8，v/v)，激發(fā)波長(zhǎng)為225nm，發(fā)射波長(zhǎng)為310nm。方法測(cè)定低限為5ng/g，在100ppb添加水平的回收率為77.6%～81.5%。

安洪澤等采用反相HPLC-UVD-FLD法測(cè)定豬飼料中克倫特羅、沙丁胺醇、非諾特羅、萊克多巴胺和班布特羅。在C18色譜柱上，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1mL/min，UVD檢測(cè)波長(zhǎng)249nm(克倫特羅)，F(xiàn)LD激發(fā)波長(zhǎng)226nm、發(fā)射波長(zhǎng)306nm(沙丁胺醇、非諾特羅、萊克多巴胺和班布特羅)進(jìn)行串聯(lián)檢測(cè)。方法檢測(cè)限(LOD)為20ug/kg，LOQ為50ug/kg，平均回收率范圍為86.7%～103.5%，CV范圍為1.5%～9.5%。

一些β-受體激動(dòng)劑具有電化學(xué)活性，可在電極上發(fā)生氧化反應(yīng)，可采用ECD檢測(cè)，來(lái)提高靈敏度。Turberg等采用HPLC-ECD檢測(cè)了豬血清和猴血漿中萊克多巴胺殘留。HPLC采用等度洗脫，電壓為+700mV，運(yùn)行時(shí)間6.5min。方法線性范圍為0.5～40ng/mL，LOQ為2ng/mL。Zhang等采用HPLC-庫(kù)侖電極檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)豬肝中的克倫特羅殘留情況進(jìn)行分析。四個(gè)電極串聯(lián)使用，電位分別為450mV、600mV、650mV和680mV，從而避免了其他ECD檢測(cè)中β-受體激動(dòng)劑能在高電位作用下被不可逆的氧化的缺點(diǎn)，提高了HPLC的選擇性和精密度。同時(shí)，研究了流動(dòng)相pH對(duì)保留時(shí)間和峰高的影響和克倫特羅在石墨電極上的電化學(xué)行為。該方法線性良好，檢測(cè)限為1.2ng/g。

2)氣相色譜法(gas chromatography，GC)

GC與電子捕獲檢測(cè)器(ECD)、氮磷檢測(cè)器(NPD)、氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)等結(jié)合，檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑具有檢測(cè)精密度高、分離度好，能分離其同位素、同分異構(gòu)體、對(duì)映體等優(yōu)點(diǎn)，但也具有樣品需要衍生化，不能定性等缺點(diǎn)。

用GC測(cè)定β-受體激動(dòng)劑通常需要衍生化來(lái)提高檢測(cè)靈敏度，最常用的衍生化技術(shù)是硅烷化技術(shù)，常用的衍生化試劑是雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。盡管有用環(huán)狀二甲基硅烷嗎啉(DMS)、甲基硼酸(MBA)等作為衍生化試劑的報(bào)道，由于其使用有一定的局限(如對(duì)特布它林無(wú)法生成衍生物)，而限制了使用范圍。采用BSTFA進(jìn)行衍生化反應(yīng)如圖1-2。

圖1-2 β-受體激動(dòng)劑與BSTFA的衍生化反應(yīng)

崔曉明等建立了GC分析動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅殘留量的方法。采用固相萃取分離富集動(dòng)物組織中的鹽酸克倫特羅，經(jīng)BSTFA衍生化后用GC-ECD檢測(cè)，以外標(biāo)法多點(diǎn)校準(zhǔn)定量。測(cè)得動(dòng)物組織中克倫特羅的峰面積與樣品濃度在0.005～1.0ug/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999，肉樣的加標(biāo)回收率在70%～80%，最低檢出限為1ug/kg。謝維平等采用厚膜非極性柱對(duì)未經(jīng)衍生化的克倫特羅直接分離，用NPD檢測(cè)，分離峰形良好，平均回收率為86.0%，RSD為5.0%，相關(guān)系數(shù)為0.9993，線性范圍為0.1～40.0mg/L，檢測(cè)限為0.03mg/L。黃盈煜等提取內(nèi)臟組織中的克倫特羅后，用乙酸酐衍生化，再采用GC-NPD檢測(cè)。該方法線性范圍為5～250ug/kg，最小檢測(cè)濃度為0.011ug/mL。Engelmann等采用固相微萃取(SPME)提取凈化樣品中的克倫特羅，在進(jìn)樣口硅烷化衍生后，用GC-FID測(cè)定其六甲基二硅衍生物，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1.1ppb。

3)毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有分離效率高、分析速度快、重現(xiàn)性好、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有很大的操作靈活性，許多分離參數(shù)如緩沖液的組成、pH、毛細(xì)管的類(lèi)型、所用電場(chǎng)的波形等都可以調(diào)節(jié)，分離效率可達(dá)幾百萬(wàn)理論塔板數(shù)，被視為高效的分離技術(shù)之一。Gausepohl等利用CE-UVD來(lái)檢測(cè)尿樣中克倫特羅對(duì)映體的殘留情況。樣品用己烷-叔丁基甲基醚(99.5+0.5，v/v)提取后，電動(dòng)注射進(jìn)樣(50s，10kV)，磷酸鹽緩沖液(pH3.3)和羥乙基-β-環(huán)糊精作為手性選擇劑。整個(gè)分析時(shí)間小于15min，以S-(-)-布拉洛爾為內(nèi)標(biāo)，克倫特羅對(duì)映體的檢測(cè)限為0.5ng/mL。管月清等采用CE-ECD法測(cè)定了肉制品中克倫特羅和沙丁胺醇的含量?？疾炝司彌_液酸度和濃度、分離電壓、氧化電位和進(jìn)樣時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)分離檢測(cè)的影響，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，工作電極為直徑300um的碳圓盤(pán)電極，檢測(cè)電位為+950mV(vs.SCE)，緩沖液為40mmol/L硼砂溶液(pH7.4)，分離電壓18kV，在8min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)二者的分離，且在兩個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，LOD分別為1.11×107mol/L和9.80×103mol/L，且抗壞血酸對(duì)其檢測(cè)不產(chǎn)生干擾。

上一篇：β-受體激動(dòng)劑殘留測(cè)定方法（一）

下一篇：β-受體激動(dòng)劑殘留測(cè)定方法（三）

食品安全檢測(cè)服務(wù)聯(lián)系電話：13613841283

標(biāo)簽:

食品安全網(wǎng) ：https://www.food12331.com

上一篇：β-受體激動(dòng)劑殘留測(cè)定方法（三）

下一篇：返回列表